3.3.4.2 Pembuatan Media MS dengan Antibiotik ppm
Tahapan yang dilakukan selanjutnya setelah pembuatan larutan stok adalah pembuatan medium MS Murashige and Skoog dengan antibiotik ppm.
Langkah-langkah pembuatan media MS dengan antibiotik ppm yaitu sebagai berikut :
1. Memasukkan larutan stok A, B, C, D, E, F, myo-inositol masing-masing 5 ml,
vitamin 2 ml dan antibiotik ppm sebanyak 1 ml ke dalam gelas piala. 2.
Menambahkan gula pasir sebanyak 30 gram dan aquades sehingga volume menjadi 1000 ml.
3. Mengukur kadar pH larutan yang berkisar antara pH 5 - 6. Jika pH 5 maka
ditambahkan larutan NaOH secara bertahap sehingga media mencapai pH 5 - 6 dan jika pH 6 maka ditambahkan larutan HCl secara bertahap sehingga
media mencapai pH 5 - 6. 4.
Memasukkan agar-agar bubuk sebanyak 6 gram ke dalam larutan dan diaduk hingga rata kemudian larutan media dimasukkan dalam panci dan dimasak
hingga mendidih. 5.
Media yang telah mendidih dimasukkan dalam botol kultur dengan ukuran masing-masing 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. 6.
Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. 7.
Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70 kemudian disimpan di dalam lemari
dengan suhu ruangan.
3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan
Pada media perlakuan, ditambahkan BAP dan TDZ sesuai konsentrasi yang telah ditentukan. Pembuatan media perlakuan ini diawali dengan proses yang
sama pada pembuatan media kontrol MS + ppm 1 ml. Penambahan BAP dan
TDZ dilakukan sebelum pengenceran dengan air aquades hingga menjadi volume akhir satu liter. Larutan yang telah diencerkan diukur kadar pH nya menggunakan
pH meter, sehingga diperoleh kisaran pH yang umum digunakan yaitu pH 5 - 6. Setelah itu, larutan yang memiliki kadar pH 5 - 6 dituang ke dalam panci
kemudian dicampurkan agar-agar. Larutan yang telah tercampur agar-agar dimasak hingga mendidih dan dituang ke dalam botol-botol kultur yang telah
steril masing-masing sebanyak 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. Botol
yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol
70 kemudian disimpan di dalam lemari dengan suhu ruangan.
3.3.5 Penanaman
Cawan petri yang akan digunakan untuk penanaman, terdiri dari dua macam yaitu cawan petri berukuran kecil yang berisi tissue dan cawan petri
berukuran besar. Cawan petri berukuran kecil dan berukuran besar terlebih dahulu disterilisasi menggunakan autoklaf dan cawan petri tersebut dimasukkan ke
laminar air flow cabinet. Untuk peletakan eksplan dilakukan dengan dua cara yaitu cawan petri yang berukuran kecil bertujuan untuk mengurangi air yang
menempel pada eksplan sedangkan cawan petri berukuran besar bertujuan untuk memotong eksplan yang berukuran 1-2 cm. Pemotongan eksplan dilakukan pada
bagian eksplan yang luka dan terkena bahan sterilan. Potongan eksplan kemudian ditanam pada media kultur. Botol kultur yang telah ditanam eksplan ditutup rapat
dengan menggunakan aluminium foil dan plastik kemudian diikat dengan karet dan dilapisi dengan plastik wrap. Setelah tahap inisiasi, botol kultur yang telah
berisi eksplan diletakkan di ruang kultur yang suhu dan cahaya telah diatur. Cahaya yang digunakan pada pagi hingga sore hari yaitu dari pantulan cahaya
matahari, sedangkan pada sore hingga malam hari menggunakan cahaya lampu.
3.3.6 Pengamatan
Pengamatan terhadap hasil inisiasi dilakukan selama 4 minggu setelah tanam MST, setiap 1 minggu sekali. Adapun parameter yang diamati adalah :
1. Persentase rata-rata eksplan tumih yang hidup ditandai dengan eksplan yang
berwarna kehijauan 2.
Persentase rata-rata eksplan yang mengalami kontaminasi ditandai dengan munculnya kontaminan berupa jamur dan bakteri
3. Persentase rata-rata eksplan yang mengalami pencokelatan browning
Kategori