4. Eksplan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak dua kali masing-
masing 5 menit. Proses sterilisasi lanjut di dalam laminar air flow cabinet yaitu pencucian
eksplan menggunakan air steril sebanyak satu kali selama 5 menit. Setelah itu, eksplan direndam menggunakan larutan HgCl
2
0,1 gram100 ml 20 selama 7 menit. Selanjutnya, perendaman eksplan dilakukan menggunakan Clorox 5
selama 3 menit, kemudian perendaman eksplan dengan larutan betadine 10 tetes100 ml selama 5 menit. Eksplan yang telah direndam dengan betadine dibilas
menggunakan air steril sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit.
3.3.4 Pembuatan Media Kultur
3.3.4.1 Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan media dasar kultur yaitu membuat larutan stok yang terdiri atas larutan stok A, larutan stok B, larutan stok C, larutan stok D, larutan stok E,
larutan stok F, stok myo-inositol, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh. Masing-masing unsur pembentuk larutan stok ditimbang kemudian dilarutkan ke
dalam air steril sebanyak satu liter dan disimpan di tempat bertemperatur rendah lemari es. Komposisi masing-masing larutan stok dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3 Komposisi masing-masing larutan stok
No. Larutan Stok
Rumus Kimia Komposisisenyawa
Konsentrasi MS g200 ml
1 Stok A
Amonium Nitrat NH
4
NO
3
66 2
Stok B Kalium Nitrat
KNO
3
76 3
Stok C Kalium Dihidrogen Fosfat
Asam Borat Kalium Iodida
Natrium Molibdat Kobalt Klorida
KH
2
PO
4
H
3
BO
3
Kl Na
2
MoO
4
. 2H
2
O CoCl
2
. 6H
2
O 6,8
0,25 0,03
0,01 0,01
4 Stok D
Kalsium Klorida CaCl
2
. 2H
2
O 1,76
5 Stok E
Magnesium Sulfat Mangan Sulfat
Zink Sulfat Tembaga Sulfat
MgSO
4
. 7H
2
O MnSO
4
. 4H
2
O ZnSO
4
. 4H
2
O CuSO
4
. 5H
2
O 1,48
0,89 0,34
0,01
6 Stok F
Na
2
EDTA Besi II Sulfat
C
10
H
14
N
2
Na
2
O
8
. 2H
2
O FeSO
4 .
7H
2
O 1,11
1,49 7
Vitamin Nicotinic Acid
Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl
Glycine C
6
H
6
N
2
O C
8
H
11
NO
3
. HCl C
12
H
17
N
4
OS. HCl C
2
H
5
NO
2
0,02 0,02
0,04 0,08
8 Myo-inositol
Myo-inositol 4
Sumber : Murashige dan Skoog 1962 dalam Zulkarnain 2009
3.3.4.2 Pembuatan Media MS dengan Antibiotik ppm
Tahapan yang dilakukan selanjutnya setelah pembuatan larutan stok adalah pembuatan medium MS Murashige and Skoog dengan antibiotik ppm.
Langkah-langkah pembuatan media MS dengan antibiotik ppm yaitu sebagai berikut :
1. Memasukkan larutan stok A, B, C, D, E, F, myo-inositol masing-masing 5 ml,
vitamin 2 ml dan antibiotik ppm sebanyak 1 ml ke dalam gelas piala. 2.
Menambahkan gula pasir sebanyak 30 gram dan aquades sehingga volume menjadi 1000 ml.
3. Mengukur kadar pH larutan yang berkisar antara pH 5 - 6. Jika pH 5 maka
ditambahkan larutan NaOH secara bertahap sehingga media mencapai pH 5 - 6 dan jika pH 6 maka ditambahkan larutan HCl secara bertahap sehingga
media mencapai pH 5 - 6. 4.
Memasukkan agar-agar bubuk sebanyak 6 gram ke dalam larutan dan diaduk hingga rata kemudian larutan media dimasukkan dalam panci dan dimasak
hingga mendidih. 5.
Media yang telah mendidih dimasukkan dalam botol kultur dengan ukuran masing-masing 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. 6.
Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. 7.
Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70 kemudian disimpan di dalam lemari
dengan suhu ruangan.
3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan
