Sterilisasi lingkungan kerja untuk kultur in vitro terdiri dari lingkungan umum ruang transfer secara keseluruhan dan lingkungan khusus lingkungan di dalam
laminar air flow cabinet. Steriliasi alat-alat kerja yaitu pinset, skalpel, gunting dan botol kultur
dicuci menggunakan deterjen sampai bersih kemudian dikeringkan. Alat-alat tersebut dibungkus menggunakan kertas koran kemudian diautoklaf selama satu
jam pada suhu 121 ⁰C sampai 126⁰C dan tekanan 1,5 atm. Alat-alat yang telah
diautoklaf dimasukkan ke dalam laminar air flow cabinet untuk disinari ultraviolet UV. Sterilisasi pada laminar air flow cabinet yaitu dengan
menyemprot permukaan atau meja kerja dengan alkohol 70 dan menghidupkan blower pada laminar air flow cabinet. Lampu ultraviolet dalam laminar air flow
cabinet dinyalakan selama satu hingga dua jam sebelum melakukan kegiatan di laminar air flow cabinet, ini bertujuan untuk mengurangi kontaminan di tempat
kerja. Pinset dan mata pisau yang digunakan pada proses inisiasi dicelupkan ke dalam alkohol 70 dan dibakar di atas api bunsen untuk menjaga sterilitas
sebelum kegiatan pemotongan dan penanaman eksplan. Media kultur yang digunakan disterilkan menggunakan autoklaf selama 20
menit pada suhu 121 ⁰C sampai 126⁰C dengan tekanan 1,5 atm. Untuk mengetahui
perubahan atau kontaminasi yang terjadi sebelum digunakan, media perlu disimpan selama dua hingga tiga hari.
Perlakuan sterilisasi yang dilakukan merupakan perlakuan yang dianggap optimal berdasarkan literatur dikarenakan jumlah eksplan yang terbatas. Proses
sterilisasi eksplan yang dilakukan yaitu sterilisasi di luar dan di dalam laminar air flow cabinet. Proses sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet yaitu:
1. Anakan tumih yang telah dikarantina, diambil pucuk yang masih menguncup
dari bahan induk dengan panjang 1-2 cm. 2.
Eksplan pucuk yang telah dipotong dari bahan induk dicuci bersih pada air mengalir dan diusap dengan kapas basah untuk menghilangkan kotoran yang
menempel. 3.
Pencucian eksplan dengan deterjen sebanyak sepertiga sendok spatula selama 10 menit, kemudian eksplan dicuci bersih.
4. Eksplan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak dua kali masing-
masing 5 menit. Proses sterilisasi lanjut di dalam laminar air flow cabinet yaitu pencucian
eksplan menggunakan air steril sebanyak satu kali selama 5 menit. Setelah itu, eksplan direndam menggunakan larutan HgCl
2
0,1 gram100 ml 20 selama 7 menit. Selanjutnya, perendaman eksplan dilakukan menggunakan Clorox 5
selama 3 menit, kemudian perendaman eksplan dengan larutan betadine 10 tetes100 ml selama 5 menit. Eksplan yang telah direndam dengan betadine dibilas
menggunakan air steril sebanyak tiga kali masing-masing selama 5 menit.
3.3.4 Pembuatan Media Kultur
3.3.4.1 Pembuatan Larutan Stok
Pembuatan media dasar kultur yaitu membuat larutan stok yang terdiri atas larutan stok A, larutan stok B, larutan stok C, larutan stok D, larutan stok E,
larutan stok F, stok myo-inositol, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh. Masing-masing unsur pembentuk larutan stok ditimbang kemudian dilarutkan ke
dalam air steril sebanyak satu liter dan disimpan di tempat bertemperatur rendah lemari es. Komposisi masing-masing larutan stok dapat dilihat pada tabel 3.
Tabel 3 Komposisi masing-masing larutan stok
No. Larutan Stok
Rumus Kimia Komposisisenyawa
Konsentrasi MS g200 ml
1 Stok A
Amonium Nitrat NH
4
NO
3
66 2
Stok B Kalium Nitrat
KNO
3
76 3
Stok C Kalium Dihidrogen Fosfat
Asam Borat Kalium Iodida
Natrium Molibdat Kobalt Klorida
KH
2
PO
4
H
3
BO
3
Kl Na
2
MoO
4
. 2H
2
O CoCl
2
. 6H
2
O 6,8
0,25 0,03
0,01 0,01
4 Stok D
Kalsium Klorida CaCl
2
. 2H
2
O 1,76
5 Stok E
Magnesium Sulfat Mangan Sulfat
Zink Sulfat Tembaga Sulfat
MgSO
4
. 7H
2
O MnSO
4
. 4H
2
O ZnSO
4
. 4H
2
O CuSO
4
. 5H
2
O 1,48
0,89 0,34
0,01
6 Stok F
Na
2
EDTA Besi II Sulfat
C
10
H
14
N
2
Na
2
O
8
. 2H
2
O FeSO
4 .
7H
2
O 1,11
1,49 7
Vitamin Nicotinic Acid
Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl
Glycine C
6
H
6
N
2
O C
8
H
11
NO
3
. HCl C
12
H
17
N
4
OS. HCl C
2
H
5
NO
2
0,02 0,02
0,04 0,08
8 Myo-inositol
Myo-inositol 4
Sumber : Murashige dan Skoog 1962 dalam Zulkarnain 2009
3.3.4.2 Pembuatan Media MS dengan Antibiotik ppm
Tahapan yang dilakukan selanjutnya setelah pembuatan larutan stok adalah pembuatan medium MS Murashige and Skoog dengan antibiotik ppm.
Langkah-langkah pembuatan media MS dengan antibiotik ppm yaitu sebagai berikut :
1. Memasukkan larutan stok A, B, C, D, E, F, myo-inositol masing-masing 5 ml,
vitamin 2 ml dan antibiotik ppm sebanyak 1 ml ke dalam gelas piala. 2.
Menambahkan gula pasir sebanyak 30 gram dan aquades sehingga volume menjadi 1000 ml.
3. Mengukur kadar pH larutan yang berkisar antara pH 5 - 6. Jika pH 5 maka
ditambahkan larutan NaOH secara bertahap sehingga media mencapai pH 5 - 6 dan jika pH 6 maka ditambahkan larutan HCl secara bertahap sehingga
media mencapai pH 5 - 6. 4.
Memasukkan agar-agar bubuk sebanyak 6 gram ke dalam larutan dan diaduk hingga rata kemudian larutan media dimasukkan dalam panci dan dimasak
hingga mendidih. 5.
Media yang telah mendidih dimasukkan dalam botol kultur dengan ukuran masing-masing 10 ml. Botol yang telah dituang media, ditutup menggunakan
plastik dan diikat menggunakan karet sampai tertutup rapat. 6.
Botol yang telah berisi media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 121
o
C sampai 126
o
C dan tekanan 1,5 atm. 7.
Botol berisi media yang telah diautoklaf dibungkus menggunakan plastik yang telah disemprot dengan alkohol 70 kemudian disimpan di dalam lemari
dengan suhu ruangan.
3.3.4.3 Pembuatan Media Perlakuan
Pada media perlakuan, ditambahkan BAP dan TDZ sesuai konsentrasi yang telah ditentukan. Pembuatan media perlakuan ini diawali dengan proses yang
sama pada pembuatan media kontrol MS + ppm 1 ml. Penambahan BAP dan
TDZ dilakukan sebelum pengenceran dengan air aquades hingga menjadi volume akhir satu liter. Larutan yang telah diencerkan diukur kadar pH nya menggunakan
pH meter, sehingga diperoleh kisaran pH yang umum digunakan yaitu pH 5 - 6. Setelah itu, larutan yang memiliki kadar pH 5 - 6 dituang ke dalam panci
