24 hidrolisis, seperti diketahui bahwa pH akan mempengaruhi kinerja dari enzim lipase
yang digunakan sedangkan jumlah air yang ditambahkan akan mempengaruhi aktivasi enzim dan proses hidrolisis yang berlangsung. Air yang digunakan pada penelitian ini
adalah air yang telah disuling atau yang juga dikenal dengan akuades. Sebelum ditambahkan pada campuran bahan, dilakukan pengukuran pH terhadap air yang
ditambahkan. Air tersebut memiliki pH netral yang bernilai 7, sedangkan buffer yang ditambahkan bervariasi tergantung kondisi pH pada desain percobaan.
Gambar 9a memperlihatkan grafik 3D-surface dari plot data penelitian yang dilakukan. Grafik ini berbentuk menyerupai parabola dan terlihat seimbang pada
kedua sisi, titik pusat percobaan pun terletak tepat di tengah parabola. Hal ini menunjukkan hasil percobaan yang baik karena kondisi faktor yang diharapkan akan
mengoptimumkan respon mendekati titik pusat percobaan. Pada Gambar 9b ditampilkan grafik kontur kombinasi faktor pH dan
penambahan air. Pada kombinasi kedua faktor, titik merah yang menyimbolkan titik pusat percobaan terlihat berada di lingkaran kontur terdalam. Apabila diberikan titik
biru yang menyimbolkan respon optimum yang diharapkan, terlihat titik pusat percobaan tidak terletak jauh dari titik biru tersebut. Hal ini menunjukkan hasil
perlakuan percobaan telah mendekati hasil respon yang diharapkan, sehingga kondisi faktor yang ada tidak bergeser terlalu jauh. Ketika ditarik garis secara horizontal ke
arah kiri terlihat bahwa penambahan air sebaiknya sedikit lebih banyak dari 5 ⁄ ,
sedangkan ketika ditarik garis vertikal ke bawah diketahui bahwa nilai respon akan optimum apabila kondisi pH sedikit di atas 5. Berdasarkan hasil analisa lipase yang
digunakan oleh Amano Pharmaceutical Manufacturing Co. seperti yang terlihat pada Lampiran 2, diketahui Amano Lipase A dari Aspergillus niger bekerja dengan baik
pada pH 6,5 namun hasil percobaan menunjukkan bahwa tingkat hidrolisis tertinggi dicapai ketika pH pada kondisi di bawahnya. Kemungkinan hal ini disebabkan kondisi
pengujian yang berbeda oleh Amano Pharmaceutical Manufacturing Co. dengan kondisi hidrolisis yang dilakukan selama penelitian ini. Adanya tambahan bahan-
bahan yang juga berbeda dengan kondisi saat pengujian dapat mempengaruhi hasil. Buffer juga dikenal dengan larutan penyangga, yaitu larutan yang mampu
mempertahankan pH atau juga dapat didefinisikan sebagai larutan yang nilai pH-nya tidak mengalami perubahan apabila ditambahkan sedikit asam kuat maupun basa kuat.
Buffer asam terbentuk dari campuran asam lemah dengan basa konjugasinya A
-
, sedangkan buffer basa terbentuk dari campuran basa lemah dan asam konjugasinya
B
-
. Buffer asam akan mempertahankan pH pada daerah bernilai pH dibawah 7, sebaliknya untuk buffer basa akan menjaga pH tetap berada pada pH di atas 7.
Pada suatu campuran yang terdapat buffer, apabila ditambahkan sedikit asam kuat maka kesetimbangan akan bergeser ke arah kiri, ion H
+
yang ditambahkan akan bereaksi dengan ion A
-
dan membentuk HA sehingga pada kesetimbangan yang baru tidak terdapat perubahan konsentrasi H
+
yang berarti dan nilai pH dapat dipertahankan pada kisarannya. Hal yang serupa terjadi ketika ditambahkan sedikit basa kuat,
kesetimbangan akan bergeser ke arah kanan dengan bereaksinya ion OH
-
dari basa kuat dengan H
+
dari larutan membentuk air sehingga nilai pH tetap dapat dipertahankan. Pada penelitian ini dilakukan perlakuan penambahan air yang berbeda-
beda, namun hal itu tidak mempengaruhi nilai pH pada campuran karena adanya buffer. Penambahan air tersebut diharapkan mampu mengaktifkan sisi katalitik enzim
25 lipase serta meningkatkan fleksibilitas dan mobilitas enzim dalam menghidrolisis
substratnya. Ketika suatu campuran ditambahkan H
2
O, air tersebut akan terurai menjadi H+ dan OH-, namun konsentrasinya sangat kecil sehingga dapat diabaikan
dan tidak akan mengganggu nilai pH.
a
b Gambar 9. a Grafik 3D-surface respon permukaan proses hidrolisis pada
perlakuan pH dan penambahan air b Grafik kontur respon permukaan proses hidrolisis pada
perlakuan pH dan penambahan air
26
4.3.5. Faktor pH dan Kecepatan Pengadukan BD
Kombinasi faktor pH dan kecepatan pengadukan memiliki nilai F-hitung sebesar 0,25 pada perhitungan ANOVA. Nilai ini cukup rendah apabila dibandingkan
dengan kombinasi faktor-faktor sebelumnya. Nilai tersebut mengindikasikan pengaruh kombinasi kedua faktor pada respon. Rendahnya nilai F-hitung menunjukkan bahwa
kombinasi faktor pH dan kecepatan pengadukan tidak memberikan pengaruh yang nyata pada respon tingkat hidrolisis.
Seperti yang telah diketahui dari pembahasan sebelumnya bahwa pH akan mempengaruhi kinerja dan stabilitas enzim lipase yang digunakan, dengan
penggunaan buffer diharapkan mampu mempertahankan pH selama hidrolisis berlangsung. Apabila dilihat dari grafik kontur kombinasi kedua faktor diketahui
bahwa pH yang menghasilkan respon optimum terletak sedikit di atas 5, sedangkan faktor kecepatan pengadukan pada kondisi lebih dari 200 rpm. Pergeseran faktor
kecepatan pengadukan cukup jauh dari titik respon optimum yang diharapkan. Hal ini juga mempengaruhi plot data pada grafik 3D-surface yang cenderung lebih tinggi
pada permukaan lengkungan di sebelah kiri. Setiap enzim memiliki pH optimal yang menjaga kinerja maupun strukturnya
dalam suatu lingkungan tempat enzim bekerja. Perubahan pH media akan memicu ionisasi pada sisi rantai asam amino dan mengganggu struktur alami enzim sehingga
enzim terdenaturasi. Percobaan yang dilakukan mendapatkan respon tertinggi pada kondisi pH 5 dan diharapkan akan optimum pada pH sedikit di atas 5. Hal ini sesuai
dengan pernyataan Petersen et al. 2001 bahwa lipase dari Aspergillus niger aktif pada lingkungan yang memiliki rentang pH 4,5-6,5. Hasil dari percobaan masih
berada dalam rentang pH tersebut, apabila pH berada di bawah rentang pH optimum enzim akan mengalami penggumpalan karena lipase dari Aspergillus niger memiliki
titik isoelektrik pada pH 4,1. Kecepatan pengadukan yang bervariasi juga akan menghasilkan respon yang
bervariasi. Peningkatan kecepatan pengadukan akan meningkatkan pula tingkat hidrolisis minyak karena pergerakan molekul yang semakin cepat. Peluang
bertemunya enzim dengan substrat juga akan lebih besar apabila kecepatan dinaikkan, namun apabila kecepatan terlampau tinggi hidrolisis tidak akan berlangsung dengan
baik karena waktu kontaknya yang cenderung lebih singkat. Seperti yang terjadi pada penelitian Savitri 2004, ketika mencoba melakukan
penentuan kondisi optimum kecepatan pengadukan dalam sintesis selulosa asetat didapatkan hasil yield yang justru menurun karena kecepatan pengadukan yang
terlampau tinggi. Ketika kecepatan pengadukan diperbesar terjadi peningkatan pada kecepatan asetilasinya, namun kecepatan reaksi hidrolisis justru lebih besar dari
kecepatan asetilasinya sehingga produk yang dihasilkan menjadi berkurang.
4.3.6. Faktor Penambahan Air dan Kecepatan Pengadukan CD
Selain suhu dan pH, faktor lain yang juga mempengaruhi berlangsungnya hidrolisis enzimatik adalah penambahan air dan kecepatan pengadukan. Adanya air
mempengaruhi reaksi yang terjadi, dimana pada prinsipnya air dapat membantu terjadinya kontak antara substrat dengan enzim. Di sisi lain, enzim lipase aktif pada
permukaan antara lapisan air dan minyak, sehingga adanya pengadukan akan membantu terjadinya kontak ini.
27 Grafik kontur ini menunjukkan hubungan antara faktor C dan D, dimana C
merupakan simbol dari penambahan air dan D adalah kecepatan pengadukan. Sementara itu, faktor A dan B menyimbolkan suhu dan pH. Grafik digambarkan
dengan rentang dari 4 hingga 6 ⁄ untuk faktor C dan rentang nilai 150 hingga 250
untuk faktor D, sedangkan faktor A dan B pada kondisi nilai titik pusat, yaitu 45
o
C dan pH 5.
Seperti pada pembahasan kedua faktor sebelumnya, grafik kontur menunjukkan bahwa nilai respon terbaik dari desain percobaan yang dilakukan
terletak pada wilayah merah yang merupakan wilayah maksimum. Meski demikian, nilai respon optimum dari perhitungan software akan diperoleh apabila penambahan
air lebih dari 5 ⁄ , namun nilainya tidak bergeser terlalu jauh dari titik pusat. Hasil
ini juga sesuai dengan penelitian yang dilakukan Raharja et al. 2010, dimana seiring meningkatnya jumlah air yang ditambahkan dari rentang 1 hingga 5
⁄ tingkat hidrolisis juga meningkat, dari penelitian tersebut didapatkan tingkat hidrolisis
tertinggi pada penambahan air 5 ⁄ Hal tersebut didukung dengan pernyataan
Paiva et al. 2000 bahwa aktivitas lipase dalam pelarut organik didukung oleh penggunaan air optimum pada rentang 0,75 hingga 5
⁄ . Meski demikian, jumlah air yang terlalu sedikit akan mengurangi kemungkinan
kontak antara lipase dengan air yang bertindak sebagai pereaksi, sedangkan jumlah air yang terlalu besar akan menghambat kontak. Penggunaan air yang berlebihan akan
mengakibatkan reaksi hidrolisis trasilgliserol yang berlebihan, sehingga asam lemak bebas akan meningkat Paez et al., 2003.
Berdasarkan plot grafik model, perlakuan kecepatan pengadukan yang diharapkan mampu mengoptimalkan respon juga lebih dari titik pusat faktor ini, yaitu
200. Pada hasil percobaan terlihat adanya peningkatan tingkat hidrolisis hingga 200 rpm, hal ini terjadi karena seiring naiknya kecepatan pengadukan juga dapat
mempertinggi kecepatan pindah enzim dari fasa air ke antar fasa dan pindahnya enzim yang inaktif dari antar fasa ke fasa air. Proses tersebut menyebabkan hidrolisis yang
terjadi di antar fasa juga akan semakin cepat. Namun, ketika kecepatan pengadukan dinaikkan menjadi 250 dan 300 rpm terjadi penurunan tingkat hidrolisis. Hal ini juga
terjadi pada penelitian Sulaswatty 1998, dimana pada saat kecepatan pengadukan dinaikkan dari 90 rpm menjadi 150 rpm terjadi peningkatan tingkat hidrolisis. Namun,
pada saat kecepatan kembali dinaikkan menjadi 210 rpm, hasil yang diharapkan menurun. Terdapat dugaan bahwa pada kecepatan pengadukan yang terlalu tinggi
mengakibatkan kontak antara substrat dan enzim tidak cukup untuk membentuk produk sehingga hidrolisis tidak terjadi dengan sempurna.
Kombinasi kedua faktor ini pada perhitungan ANOVA memiliki nilai F-hitung sebesar 0,11. Nilai tersebut merupakan nilai paling rendah dibandingkan kombinasi
faktor lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa kombinasi faktor penambahan air dan kecepatan pengadukan tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap respon.
4.4. PENENTUAN TITIK OPTIMAL FAKTOR
Berdasarkan percobaan sebelumnya, dapat ditentukan bahwa perlakuan kecepatan pengadukan pada 200 rpm akan menjadi nilai faktor di level 0 pada rancangan selanjutnya
menggunakan RSM. Rentang nilai pada setiap levelnya ialah 50 rpm, penentuan ini sama dengan rentang nilai kecepatan pengadukan pada penelitian pendahuluan.
