38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2013 di Laboratorium Research and Development PT Biofarma, Bandung, Indonesia. Penelitian ini dilakukan
kurang lebih selama 5 bulan terhitung dari bulan Januari 2013.
3.2 Alat Penelitian
Vial, Laminar Air Flow LAF cabinet, inkubator, inkubator CO
2
, kulkas, freezer, ultra-low freezer, syringe filter Filter Acrodisc, plate 96 well,
mikroskop, mikroskop inverted, mikroskop fluorescence, pipet mikro, pipet mikro multi-channel, pipet tip, magnetic stirrer, tanki nitrogen cair, hemocytometer, T-
flasks, ice bath, dan peralatan-peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium.
3.3 Bahan Penelitian
Bulk vaksin rotavirus beku, sukrosa steril, nitrogen cair, FTM Fluid Thioglycolate Medium steril dan SCDM Soybean Casein Digest Medium steril
yang diperoleh dari bagian media PT Biofarma, sel MA 104 ginjal monyet, media pertumbuhan sel DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, FBS Fetal Bovine Serum, antibiotik, dan NaHCO
3
, aseton 80, alkohol 70, tripsin, trypan blue, antibodi poliklonal rabbit anti SA 11, antibodi IgG goat anti
rabbit, dan PBS Phosphate Buffered Saline.
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan Sediaan Kandidat Vaksin Rotavirus
Dilakukan proses sterilisasi pada alat gelas, vial, dan magnetic stirrer dengan menggunakan autoklaf suhu 121
o
C selama 15 menit. Mencairkan bulk vaksin beku hasil pemanenan menggunakan water bath, kemudian dimasukkan
kedalam gelas beker sebanyak 150 mL. Selanjutnya, virus stabilizer sukrosa dengan konsentrasi X sebanyak 57,7 mL ditambahkan dan diaduk dengan bantuan
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
magnetic stirrer dengan kecepatan yang konstan dan sesuai sambil dimonitor prosesnya. Sediaan kandidat vaksin yang diperoleh kemudian disterilkan dengan
metode filtrasi menggunakan syringe filter ukuran 0,22 µm PATH, 2006; Sultana, 2007.
Sambil terus dilakukan homogenisasi, larutan sediaan kandidat vaksin rotavirus yang sudah disterilkan kemudian dimasukkan ke dalam vial sebanyak 77
buah dengan kandungan vaksin tiap vial adalah 1 mL, dimana 75 vial nantinya akan digunakan untuk pengujian tahap selanjutnya, 2 vial digunakan untuk
evaluasi sterilitas, dan 3 vial digunakan untuk evaluasi potensi kandungan. Seluruh pekerjaan tersebut dilakukan di dalam laminar air flow cabinet dengan
bantuan TSA Tryptone Soy Agar sebagai indikator sterilitas environment PATH, 2006.
3.4.2 Variasi Perlakuan Teknik Freezing dan Suhu Penyimpanan pada
Sediaan Kandidat Vaksin Tabel 3.1 Desain perlakuan pada kandidat vaksin rotavirus
No Kode
Perlakuan Teknik Freezing
Suhu Penyimpanan -70
o
C LN
-152
o
C 2-8
o
C -20
o
C -70
o
C 1
F1 Immunofluorescence Assay Uji Potensi
2 F1T1
√ -
- √
- -
3 F1T2
√ -
- -
√ -
4 F1T3
√ -
- -
- √
5 F2
Immunofluorescence Assay Uji Potensi 6
F2T1 -
√ -
√ -
- 7
F2T2 -
√ -
- √
- 8
F2T3 -
√ -
- -
√ 9
F3 Immunofluorescence Assay Uji Potensi
10 F3T1
- -
√ √
- -
11 F3T2
- -
√ -
√ -
12 F3T3
- -
√ -
- √
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sebanyak 75 vial sediaan kandidat vaksin rotavirus yang berhasil dibuat kemudian dibekukan dengan tiga teknik yang berbeda, yakni dibekukan hingga
suhu -70
o
C rapid freezing menggunakan freezer, suhu -152
o
C slow freezing menggunakan ultra-low freezer, dan dengan nitrogen cair very rapid freezing
menggunakan tanki nitrogen cair, masing-masing 24 vial. Dari 24 vial pada tiap teknik tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan perlakuan suhu
penyimpanan yang berbeda, yakni 8 vial disimpan pada kulkas bersuhu 2 – 8
o
C, 8 vial pada freezer suhu -20
o
C, dan 8 vial terakhir pada freezer suhu -70
o
C Huynh- Ba dan Zahn, 2009; PT Biofarma.
3.4.3 Evaluasi Sediaan
Kategori