Tempat dan Waktu Penelitian Alat Penelitian Bahan Penelitian Alur Penelitian

38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2013 di Laboratorium Research and Development PT Biofarma, Bandung, Indonesia. Penelitian ini dilakukan kurang lebih selama 5 bulan terhitung dari bulan Januari 2013.

3.2 Alat Penelitian

Vial, Laminar Air Flow LAF cabinet, inkubator, inkubator CO 2 , kulkas, freezer, ultra-low freezer, syringe filter Filter Acrodisc, plate 96 well, mikroskop, mikroskop inverted, mikroskop fluorescence, pipet mikro, pipet mikro multi-channel, pipet tip, magnetic stirrer, tanki nitrogen cair, hemocytometer, T- flasks, ice bath, dan peralatan-peralatan gelas yang umum digunakan di laboratorium.

3.3 Bahan Penelitian

Bulk vaksin rotavirus beku, sukrosa steril, nitrogen cair, FTM Fluid Thioglycolate Medium steril dan SCDM Soybean Casein Digest Medium steril yang diperoleh dari bagian media PT Biofarma, sel MA 104 ginjal monyet, media pertumbuhan sel DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, FBS Fetal Bovine Serum, antibiotik, dan NaHCO 3 , aseton 80, alkohol 70, tripsin, trypan blue, antibodi poliklonal rabbit anti SA 11, antibodi IgG goat anti rabbit, dan PBS Phosphate Buffered Saline.

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan Sediaan Kandidat Vaksin Rotavirus

Dilakukan proses sterilisasi pada alat gelas, vial, dan magnetic stirrer dengan menggunakan autoklaf suhu 121 o C selama 15 menit. Mencairkan bulk vaksin beku hasil pemanenan menggunakan water bath, kemudian dimasukkan kedalam gelas beker sebanyak 150 mL. Selanjutnya, virus stabilizer sukrosa dengan konsentrasi X sebanyak 57,7 mL ditambahkan dan diaduk dengan bantuan 39 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta magnetic stirrer dengan kecepatan yang konstan dan sesuai sambil dimonitor prosesnya. Sediaan kandidat vaksin yang diperoleh kemudian disterilkan dengan metode filtrasi menggunakan syringe filter ukuran 0,22 µm PATH, 2006; Sultana, 2007. Sambil terus dilakukan homogenisasi, larutan sediaan kandidat vaksin rotavirus yang sudah disterilkan kemudian dimasukkan ke dalam vial sebanyak 77 buah dengan kandungan vaksin tiap vial adalah 1 mL, dimana 75 vial nantinya akan digunakan untuk pengujian tahap selanjutnya, 2 vial digunakan untuk evaluasi sterilitas, dan 3 vial digunakan untuk evaluasi potensi kandungan. Seluruh pekerjaan tersebut dilakukan di dalam laminar air flow cabinet dengan bantuan TSA Tryptone Soy Agar sebagai indikator sterilitas environment PATH, 2006.

3.4.2 Variasi Perlakuan Teknik Freezing dan Suhu Penyimpanan pada

Sediaan Kandidat Vaksin Tabel 3.1 Desain perlakuan pada kandidat vaksin rotavirus No Kode Perlakuan Teknik Freezing Suhu Penyimpanan -70 o C LN -152 o C 2-8 o C -20 o C -70 o C 1 F1 Immunofluorescence Assay Uji Potensi 2 F1T1 √ - - √ - - 3 F1T2 √ - - - √ - 4 F1T3 √ - - - - √ 5 F2 Immunofluorescence Assay Uji Potensi 6 F2T1 - √ - √ - - 7 F2T2 - √ - - √ - 8 F2T3 - √ - - - √ 9 F3 Immunofluorescence Assay Uji Potensi 10 F3T1 - - √ √ - - 11 F3T2 - - √ - √ - 12 F3T3 - - √ - - √ 40 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Sebanyak 75 vial sediaan kandidat vaksin rotavirus yang berhasil dibuat kemudian dibekukan dengan tiga teknik yang berbeda, yakni dibekukan hingga suhu -70 o C rapid freezing menggunakan freezer, suhu -152 o C slow freezing menggunakan ultra-low freezer, dan dengan nitrogen cair very rapid freezing menggunakan tanki nitrogen cair, masing-masing 24 vial. Dari 24 vial pada tiap teknik tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan perlakuan suhu penyimpanan yang berbeda, yakni 8 vial disimpan pada kulkas bersuhu 2 – 8 o C, 8 vial pada freezer suhu -20 o C, dan 8 vial terakhir pada freezer suhu -70 o C Huynh- Ba dan Zahn, 2009; PT Biofarma.

3.4.3 Evaluasi Sediaan

1. Uji Fisik Sediaan kandidat vaksin yang sudah dibekukan kemudian dicairkan dengan water bath, lalu diuji secara visual meliputi pengamatan volume, warna, kandungan partikel asing, dan homogenitasnya BBPMSOH, 2005. 2. Uji Sterilitas Sampel vaksin sebelum dilakukan freezing diinokulasikan ke dalam 2 tabung reaksi yang masing-masing tabung tersebut berisi media FTM Fluid Thioglycolate Medium steril dan SCDM Soybean Casein Digest Medium steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C. Kedua tabung tersebut disimpan selama 14 hari, kemudian diamati untuk melihat ada tidaknya pertumbuhan mikroorganisme kekeruhan, endapan, atau tanda-tanda pertumbuhan mikroorganisme BBPMSOH, 2005; McGuire dan Kupiec, 2007. 3. Uji Potensi Kandungan Sampel vaksin yang sudah dibuat sebanyak 3 vial dilakukan uji immunofluorescence assay untuk mencari konsentrasi rotavirus dalam vaksin tersebut, sebagai data pembanding awal sebelum dilakukan freezing dan suhu penyimpanan triplo. Prosedur immunofluorescence assay dijelaskan pada poin 3.4.4. 41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.4 Uji

Stabilitas Potensi Kandidat Vaksin Rotavirus Selama Penyimpanan Menggunakan Immunofluorescence Assay 1. Penyiapan dan Pemeliharaan Subkultur Sel MA 104 Tahap awal pemeliharaan sel MA 104 dimulai dari proses resusitasi sel dengan penyiapan dan pembuatan media pertumbuhan sel dengan mencampurkan DMEM dengan FBS, NaHCO 3 , dan antibiotik kemudian diaduk hingga homogen. Setelah media pertumbuhan selesai dibuat, media tersebut kemudian didistribusikan ke dalam T-flasks. Sel MA 104 beku yang akan digunakan lalu dicairkan dengan menggunakan ice bath dan setelah cair dimasukkan ke dalam T-flasks yang berisi medium. Dilakukan observasi sel menggunakan mikroskop untuk memastikan keadaan sel dan dilakukan inkubasi dengan inkubator CO 2 pada suhu 37 o C sampai mengalami konfluen. Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan LAF Freshney, 2005. Setelah sel sudah mengalami konfluen, dilakukan tahap subkultur sel pasase dimana medium pertumbuhan sel dikeluarkan dari T-flasks kemudian sel dicuci dengan menggunakan PBS. Setelah dicuci, kemudian dilakukan penambahan tripsin dan diinkubasi selama 5-8 menit. Setelah selesai diinkubasi, tarik kembali seluruh tripsin menggunakan pipet mikro sehingga diperoleh suspensi sel dalam T-flasks tersebut Freshney, 2005. Dilakukan penghitungan sel dengan menggunakan hemocytometer. Suspensi diaduk hingga terdispersi ke seluruh sel, dan diambil 0,2 mL sebagai sampel ke dalam vial. Kemudian dilakukan preparasi slide dimulai dengan membersihkan permukaan slide dan coverslip dengan alkohol 70 kemudian coverslip dipasang pada slide. Sampel sel yang diperoleh sebelumnya diaduk, kemudian diambil sebanyak 20 µL menggunakan mikro pipet steril dan dimasukkan ke dalam tepi slide hemocytometer. Ditambahkan pula 60 µL trypan blue sebagai pewarna sel ke dalam tepi tersebut. Setelah didiamkan beberapa saat, slide tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop perbesaran lensa objektif 10x. Dari pengamatan mikroskop dapat terlihat 9 kotak berukuran 1 mm 2 yang di dalamnya masih terdapat kotak dengan berbagai ukuran yang berpengaruh pada rumus perhitungan sel nantinya. Jika 42 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sel yang terlihat sedikit 100mm 2 , maka dilakukan penghitungan sel pada satu atau lebih kotak berukuran 1 mm 2 di sekeliling kotak tengah, tapi jika sel yang terlihat terlalu banyak 1000mm 2 , maka dilakukan penghitungan sel pada lima kotak kecil dengan arah diagonal dari kotak besar 1 mm 2 Freshney, 2005. Hasil subkultur yang baik dapat diketahui bila nilai persen viabilitasnya tinggi ≥ 90. Persen viabilitas dapat diperoleh menggunakan rumus: ………γ.1 Perhitungan densitas sel dapat dilakukan dengan rumus: ……………………………………………………………...γ.2 Lambang c selmL adalah konsentrasi sel densitas sel, n adalah nilai rata- rata jumlah sel hidup yang dihitung dalam x kotak, dan v adalah volume yang dihitung. Nilai v pada kotak besar 1 mm 2 adalah 0,1 mm 3 atau 1 x 10 -4 mL, pada kotak sedang 25 kotak pada tiap 1 kotak besar adalah 15 dari total atau 15 x 10 -4 mL, dan pada kotak kecil 16 kotak pada tiap 1 kotak sedang adalah 9 x 10 -4 mL. Rumus tersebut ditambahkan dengan faktor pengenceran, apabila ditambahkan pewarna Freshney, 2005. Cara pengambilan sel MA 104 untuk pengujian akan dijelaskan di nomor berikutnya. Untuk proses pemeliharaan sel MA 104, dilakukan kembali proses pasase. Namun sebelum masuk ke dalam proses tersebut, dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan menghitung jumlah suspensi dan media yang akan dimasukkan ke dalam wadah kultur, dalam hal ini menggunakan T-flasks ukuran luas 25 cm 2 , sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Spesifikasi alat T-flasks ini dapat memuat medium kurang lebih 10 mL. Konsentrasi sel dalam seeding yang diinginkan adalah 5 x 10 5 sel. Perhitungan jumlah suspensi dilakukan dengan menggunakan rumus pengenceran: ……………….γ.γ Jumlah media didapatkan dari 10 mL media yang dapat ditampung T- flasks dikurang jumlah suspensi yang digunakan. Setelah itu, dilakukan inkubasi dengan inkubator CO 2 pada suhu 37 o C sampai mengalami konfluen, 43 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta baru dilakukan proses pasase kembali. Hal ini dilakukan rutin selama penelitian untuk memperoleh sel MA 104 sebagai bahan untuk prosedur penelitian selanjutnya Freshney, 2005. 2. Plating Sel MA 104 Menggunakan Plate 96 Well Suspensi sel MA 104 dibuat untuk 96 well dengan konsentrasi 2,5 x 10 4 sel dalam media pertumbuhan sel sebanyak 100 µL tiap satu well. Well tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C dalam inkubator CO 2 . Setelah 24 jam inkubasi, sel tersebut telah mengalami konfluen dan dilakukan tahap berikutnya. Perhitungan jumlah mL sel dan media pertumbuhan sel diperoleh dari rumus: ……………………………………………γ.4 Volume sel yang diperoleh dari hasil perhitungan kemudian diencerkan dengan media sesuai dengan keinginan dan spesifikasi muatan plate Freshney, 2005; Patton, et al., 2000; dengan modifikasi. 3. Pengenceran Virus Dengan menggunakan plate 96 well yang berbeda, media pertumbuhan virus media pertumbuhan sel tanpa FBS yang sudah mengandung tripsin ditambahkan ke dalam tiap well sebanyak 50 µL. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara memasukkan sampel kandidat vaksin rotavirus sebanyak 50 µL kedalam well nomor 1. Kemudian terus dilakukan pengenceran dengan cara mengambil 50 µL dari well nomor 1 dan dipindahkan ke well nomor 2, seterusnya sampai well nomor 11 menggunakan pipet mikro multi-channel. Well nomor 12 dibiarkan kosong hanya berisi media pertumbuhan sebagai kontrol negatif. Sebagai kontrol positif digunakan biakan rotavirus. 4. Inokulasi Vaksin Virus yang Terkandung ke Sel Monolayer Plate 96 well MA 104 dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan media pertumbuhan virus sebanyak 50 µL lalu diinkubasi selama 30 menit. 44 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Setelah selesai diinkubasi, dipindahkan sebanyak 50 µL dari plate well titrasi pengenceran ke plate well sel MA 104 sesuai dengan nomor well-nya dan ditambahkan 50 µL media pertumbuhan virus. Plate 96 well sel MA 104 ini kemudian diinkubasi menggunakan inkubator CO 2 selama 18 jam suhu 37 o C Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi. 5. Pengamatan Mikroskop Fluorescent Setelah plate 96 well sel MA 104 selesai diinkubasi, medium yang terdapat pada tiap well dibuang menggunakan penyedot vakum, kemudian dilakukan fiksasi dengan menggunakan aseton 80 sebanyak 150 µL selama 10 menit. Setelah plate difiksasi, aseton dibuang dan plate dikering-anginkan. Plate well tersebut ditambahkan 50 µL antiserum poliklonal rabbit anti SA 11 dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 o C. Setelah itu, well 96 dicuci dengan PBS lalu ditambahkan 50 µL antiserum IgG goat anti rabbit kedalamnya dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 o C. Plate 96 well kemudian dicuci kembali dengan PBS, lalu setiap well diamati dan dihitung sel yang memancarkan fluoresence satu per satu dibawah mikroskop fluorescent. Setelah dilakukan penghitungan sel, dapat dilakukan kalkulasi konsentrasi dari suspensi virus awal tersebut dalam satuan FCFUmL. Perhitungan dapat dilakukan dengan menggunakan rumus: ⁄ …………γ.5 Pengujian stabilitas potensi ini dilakukan duplo pada kandidat vaksin rotavirus setelah penyimpanan hari ke-42, 60, 90, dan 120 pada setiap perlakuan teknik freezing Freshney, 2005; Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi.

3.4.5 Metode Analisis Data

Pengujian stabilitas potensi dilakukan dengan dua kali pengulangan duplo dan diolah secara statistika menggunakan metode rancangan acak lengkap faktorial dan dianalisis melalui ANOVA. Pengolahan data yang diperoleh dari hasil eksperimental murni ini dilakukan berdasarkan prinsip-prinsip Quality by Design, sehingga dapat diperoleh desain yang kuat dalam hal kombinasi teknik 45 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta freezing dan suhu penyimpanan yang tepat dari beberapa desain percobaan yang dilakukan.

3.5 Alur Penelitian

Bulk vaksin rotavirus Diformulasikan dengan vaksin stabilizer dan difiltrasi Kandidat vaksin rotavirus Uji fisik Uji sterilitas Analisis hasil evaluasi Uji potensi Evaluasi sediaan Suhu 2 – 8 o C Suhu -20 o C Suhu -70 o C Uji stabilitas potensi Analisis hasil uji stabilitas Immunofluorescence assay pada hari ke- 42, 60, 90, dan 120 Freezing sediaan Freezing -70 o C Freezing -152 o C Freezing dengan nitrogen cair Penyimpanan 46 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Formulasi dan Evaluasi Sediaan

Kandidat formulasi vaksin rotavirus ini dibuat dalam bentuk sediaan steril cair berupa larutan, dengan formulasi berupa bulk vaksin rotavirus dan sukrosa sebagai vaksin stabilizer. Sukrosa golongan poliol atau gula atau osmolit dipilih sebagai vaksin stabilizer karena kemampuannya yang dapat melindungi komponen seluler, terutama protein, terhadap terjadinya denaturasi akibat pengaruh lingkungan, dalam hal ini pengaruh perubahan suhu yang ekstrim. Dilakukan evaluasi umum kandidat formulasi vaksin mencakup uji fisik, uji sterilitas, dan uji potensi. Uji fisik selain dilakukan untuk mengetahui karakteristik fisik kandidat formulasi vaksin yang dibuat dan memastikan bahwa kandidat formulasi vaksin tersebut homogen, tidak mengandung partikel asing, serta tidak mengalami penyusutan volume dan perubahan warna, juga dilakukan untuk melihat ada tidaknya perbedaan yang terjadi pada setiap teknik freezing dan suhu penyimpanan. Uji sterilitas dilakukan untuk memastikan bahwa produk kandidat formulasi vaksin dalam keadaan steril tanpa adanya kontaminasi dari bakteri aerob, bakteri anaerob, maupun fungi. Uji potensi dilakukan untuk mengetahui rentang kandungan atau konsentrasi rotavirus yang masih poten di dalam sediaan kandidat formulasi vaksin rotavirus.

4.1.1 Uji Fisik

Hasil evaluasi secara fisik seperti tercantum pada tabel 4.1 menunjukkan bahwa sediaan kandidat formulasi vaksin rotavirus memenuhi persyaratan sediaan larutan. Penyusutan volume dan perubahan warna pada tiap teknik freezing tidak terjadi selama proses penyimpanan dan pada proses pencairan kandidat formulasi vaksin dari keadaan beku. Hal ini menunjukkan bahwa perbedaan teknik freezing dan suhu penyimpanan pada sediaan kandidat formulasi vaksin rotavirus secara visual tidak berpengaruh, sehingga ketiga teknik freezing dan ketiga suhu penyimpanan dapat digunakan pada kandidat formulasi vaksin ini.