40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Sebanyak 75 vial sediaan kandidat vaksin rotavirus yang berhasil dibuat kemudian dibekukan dengan tiga teknik yang berbeda, yakni dibekukan hingga
suhu -70
o
C rapid freezing menggunakan freezer, suhu -152
o
C slow freezing menggunakan ultra-low freezer, dan dengan nitrogen cair very rapid freezing
menggunakan tanki nitrogen cair, masing-masing 24 vial. Dari 24 vial pada tiap teknik tersebut kemudian dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan perlakuan suhu
penyimpanan yang berbeda, yakni 8 vial disimpan pada kulkas bersuhu 2 – 8
o
C, 8 vial pada freezer suhu -20
o
C, dan 8 vial terakhir pada freezer suhu -70
o
C Huynh- Ba dan Zahn, 2009; PT Biofarma.
3.4.3 Evaluasi Sediaan
1. Uji Fisik Sediaan kandidat vaksin yang sudah dibekukan kemudian dicairkan
dengan water bath, lalu diuji secara visual meliputi pengamatan volume, warna, kandungan partikel asing, dan homogenitasnya BBPMSOH, 2005.
2. Uji Sterilitas Sampel vaksin sebelum dilakukan freezing diinokulasikan ke dalam 2
tabung reaksi yang masing-masing tabung tersebut berisi media FTM Fluid Thioglycolate Medium steril dan SCDM Soybean Casein Digest Medium
steril, kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C. Kedua tabung tersebut disimpan selama 14 hari, kemudian diamati untuk melihat ada tidaknya pertumbuhan
mikroorganisme kekeruhan, endapan, atau tanda-tanda pertumbuhan mikroorganisme BBPMSOH, 2005; McGuire dan Kupiec, 2007.
3. Uji Potensi Kandungan Sampel vaksin yang sudah dibuat sebanyak 3 vial dilakukan uji
immunofluorescence assay untuk mencari konsentrasi rotavirus dalam vaksin tersebut, sebagai data pembanding awal sebelum dilakukan freezing dan suhu
penyimpanan triplo. Prosedur immunofluorescence assay dijelaskan pada poin 3.4.4.
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.4 Uji
Stabilitas Potensi
Kandidat Vaksin
Rotavirus Selama
Penyimpanan Menggunakan Immunofluorescence Assay
1. Penyiapan dan Pemeliharaan Subkultur Sel MA 104 Tahap awal pemeliharaan sel MA 104 dimulai dari proses resusitasi sel
dengan penyiapan dan pembuatan media pertumbuhan sel dengan mencampurkan DMEM dengan FBS, NaHCO
3
, dan antibiotik kemudian diaduk hingga homogen. Setelah media pertumbuhan selesai dibuat, media
tersebut kemudian didistribusikan ke dalam T-flasks. Sel MA 104 beku yang akan digunakan lalu dicairkan dengan menggunakan ice bath dan setelah cair
dimasukkan ke dalam T-flasks yang berisi medium. Dilakukan observasi sel menggunakan mikroskop untuk memastikan keadaan sel dan dilakukan
inkubasi dengan inkubator CO
2
pada suhu 37
o
C sampai mengalami konfluen. Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan LAF Freshney,
2005. Setelah sel sudah mengalami konfluen, dilakukan tahap subkultur sel
pasase dimana medium pertumbuhan sel dikeluarkan dari T-flasks kemudian sel dicuci dengan menggunakan PBS. Setelah dicuci, kemudian dilakukan
penambahan tripsin dan diinkubasi selama 5-8 menit. Setelah selesai diinkubasi, tarik kembali seluruh tripsin menggunakan pipet mikro sehingga
diperoleh suspensi sel dalam T-flasks tersebut Freshney, 2005. Dilakukan penghitungan sel dengan menggunakan hemocytometer.
Suspensi diaduk hingga terdispersi ke seluruh sel, dan diambil 0,2 mL sebagai sampel ke dalam vial. Kemudian dilakukan preparasi slide dimulai dengan
membersihkan permukaan slide dan coverslip dengan alkohol 70 kemudian coverslip dipasang pada slide. Sampel sel yang diperoleh sebelumnya diaduk,
kemudian diambil sebanyak 20 µL menggunakan mikro pipet steril dan dimasukkan ke dalam tepi slide hemocytometer. Ditambahkan pula 60 µL
trypan blue sebagai pewarna sel ke dalam tepi tersebut. Setelah didiamkan beberapa saat, slide tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop
perbesaran lensa objektif 10x. Dari pengamatan mikroskop dapat terlihat 9 kotak berukuran 1 mm
2
yang di dalamnya masih terdapat kotak dengan berbagai ukuran yang berpengaruh pada rumus perhitungan sel nantinya. Jika
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sel yang terlihat sedikit 100mm
2
, maka dilakukan penghitungan sel pada satu atau lebih kotak berukuran 1 mm
2
di sekeliling kotak tengah, tapi jika sel yang terlihat terlalu banyak 1000mm
2
, maka dilakukan penghitungan sel pada lima kotak kecil dengan arah diagonal dari kotak besar 1 mm
2
Freshney, 2005. Hasil subkultur yang baik dapat diketahui bila nilai persen
viabilitasnya tinggi ≥ 90. Persen viabilitas dapat diperoleh menggunakan rumus:
………γ.1 Perhitungan densitas sel dapat dilakukan dengan rumus:
……………………………………………………………...γ.2 Lambang c selmL adalah konsentrasi sel densitas sel, n adalah nilai rata-
rata jumlah sel hidup yang dihitung dalam x kotak, dan v adalah volume yang dihitung. Nilai v pada kotak besar 1 mm
2
adalah 0,1 mm
3
atau 1 x 10
-4
mL, pada kotak sedang 25 kotak pada tiap 1 kotak besar adalah 15 dari total atau
15 x 10
-4
mL, dan pada kotak kecil 16 kotak pada tiap 1 kotak sedang adalah 9 x 10
-4
mL. Rumus tersebut ditambahkan dengan faktor pengenceran, apabila ditambahkan pewarna Freshney, 2005.
Cara pengambilan sel MA 104 untuk pengujian akan dijelaskan di nomor berikutnya. Untuk proses pemeliharaan sel MA 104, dilakukan kembali
proses pasase. Namun sebelum masuk ke dalam proses tersebut, dilakukan preparasi terlebih dahulu dengan menghitung jumlah suspensi dan media yang
akan dimasukkan ke dalam wadah kultur, dalam hal ini menggunakan T-flasks ukuran luas 25 cm
2
, sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan. Spesifikasi alat T-flasks ini dapat memuat medium kurang lebih 10 mL. Konsentrasi sel
dalam seeding yang diinginkan adalah 5 x 10
5
sel. Perhitungan jumlah suspensi dilakukan dengan menggunakan rumus pengenceran:
……………….γ.γ Jumlah media didapatkan dari 10 mL media yang dapat ditampung T-
flasks dikurang jumlah suspensi yang digunakan. Setelah itu, dilakukan inkubasi dengan inkubator CO
2
pada suhu 37
o
C sampai mengalami konfluen,
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
baru dilakukan proses pasase kembali. Hal ini dilakukan rutin selama penelitian untuk memperoleh sel MA 104 sebagai bahan untuk prosedur
penelitian selanjutnya Freshney, 2005.
2. Plating Sel MA 104 Menggunakan Plate 96 Well Suspensi sel MA 104 dibuat untuk 96 well dengan konsentrasi 2,5 x
10
4
sel dalam media pertumbuhan sel sebanyak 100 µL tiap satu well. Well tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C dalam inkubator CO
2
. Setelah 24 jam inkubasi, sel tersebut telah mengalami konfluen dan dilakukan tahap
berikutnya. Perhitungan jumlah mL sel dan media pertumbuhan sel diperoleh dari rumus:
……………………………………………γ.4 Volume sel yang diperoleh dari hasil perhitungan kemudian diencerkan
dengan media sesuai dengan keinginan dan spesifikasi muatan plate Freshney, 2005; Patton, et al., 2000; dengan modifikasi.
3. Pengenceran Virus Dengan menggunakan plate 96 well yang berbeda, media pertumbuhan
virus media pertumbuhan sel tanpa FBS yang sudah mengandung tripsin ditambahkan ke dalam tiap well sebanyak 50 µL. Kemudian dilakukan
pengenceran dengan cara memasukkan sampel kandidat vaksin rotavirus sebanyak 50 µL kedalam well nomor 1. Kemudian terus dilakukan
pengenceran dengan cara mengambil 50 µL dari well nomor 1 dan dipindahkan ke well nomor 2, seterusnya sampai well nomor 11 menggunakan
pipet mikro multi-channel. Well nomor 12 dibiarkan kosong hanya berisi media pertumbuhan sebagai kontrol negatif. Sebagai kontrol positif
digunakan biakan rotavirus.
4. Inokulasi Vaksin Virus yang Terkandung ke Sel Monolayer Plate 96 well MA 104 dicuci dengan PBS kemudian ditambahkan
media pertumbuhan virus sebanyak 50 µL lalu diinkubasi selama 30 menit.
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Setelah selesai diinkubasi, dipindahkan sebanyak 50 µL dari plate well titrasi pengenceran ke plate well sel MA 104 sesuai dengan nomor well-nya dan
ditambahkan 50 µL media pertumbuhan virus. Plate 96 well sel MA 104 ini kemudian diinkubasi menggunakan inkubator CO
2
selama 18 jam suhu 37
o
C Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi.
5. Pengamatan Mikroskop Fluorescent Setelah plate 96 well sel MA 104 selesai diinkubasi, medium yang
terdapat pada tiap well dibuang menggunakan penyedot vakum, kemudian dilakukan fiksasi dengan menggunakan aseton 80 sebanyak 150 µL selama
10 menit. Setelah plate difiksasi, aseton dibuang dan plate dikering-anginkan. Plate well tersebut ditambahkan 50 µL antiserum poliklonal rabbit anti SA 11
dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Setelah itu, well 96 dicuci dengan PBS lalu ditambahkan 50 µL antiserum IgG goat anti rabbit
kedalamnya dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Plate 96 well kemudian dicuci kembali dengan PBS, lalu setiap well diamati dan dihitung
sel yang memancarkan fluoresence satu per satu dibawah mikroskop fluorescent. Setelah dilakukan penghitungan sel, dapat dilakukan kalkulasi
konsentrasi dari suspensi virus awal tersebut dalam satuan FCFUmL. Perhitungan dapat dilakukan dengan menggunakan rumus:
⁄ …………γ.5
Pengujian stabilitas potensi ini dilakukan duplo pada kandidat vaksin rotavirus setelah penyimpanan hari ke-42, 60, 90, dan 120 pada setiap perlakuan teknik
freezing Freshney, 2005; Saif dan Ward, 2000; dengan modifikasi.
3.4.5 Metode Analisis Data
