BAB 3 BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan November 2011 sampai Maret 2013 di Laboratorium Struktur Hewan, Departemen Biologi, dan Laboratorium Kimia
Organik Bahan Alam, Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk pemeliharaan hewan uji dan pemberian perlakuan yaitu kandang hewan, tempat makan dan minum hewan, jarum gavage, neraca
timbangan, dan alat tulis. Alat yang digunakan dalam pembuatan bahan uji yaitu blender, kertas saring, spatula, botol, Erlenmeyer, dan rotavapor. Untuk
pembuatan sediaan mikroskopis digunakan jarum pentul, bak bedah, dissecting set, sample cup, aluminium foil, oven, mikrotom, kuas, hot plate, gelas ukur,
beaker glass, botol zat, chamber, object glass, cover glass, kertas label dan botol balsem. Alat yang digunakan untuk pengamatan yaitu mikroskop binokuler,
kamera digital, timbangan digital, dan alat tulis, Bahan yang digunakan untuk pemeliharaan hewan uji dan pemberian
perlakuan yaitu mencit betina dewasa Mus musculus L. strain DDW yang bunting, pakan, sekam, ekstrak andaliman 2 , 4, 6, dan pelarut CMC
carboxyl metil cellulose 1. Bahan yang digunakan dalam pembuatan bahan uji yaitu buah andaliman Zanthoxzyllum acanthopodium DC. dan pelarut n-heksan.
Bahan yang digunakan untuk pembuatan sediaan mikroskopis yaitu larutan NaCl 0,9, larutan Bouin, alkohol 100, 96, 80, 70, 60, 50, 40, 30,
aquadest, xylol, parafin, holder, canada balsam, pewarna hematoksilin dan eosin.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Pembuatan Bahan Uji
Buah andaliman diperoleh dari daerah Dairi, Kabupaten Tapanuli Utara. Buah andaliman yang masih bercampur dipisahkan untuk memperoleh buah yang
masih segar kemudian dikeringkan dalam suhu kamar sampai kering. Buah yang telah kering diblender hingga menjadi simplisia serbuk, kemudian dimasukkan
ke dalam stoples dan disimpan pada suhu kamar. Simplisia yang telah dihasilkan dimaserasi dengan cara memasukkan simplisia ke dalam botol dan ditambahkan
pelarut n-heksan sampai terendam. Campuran tersebut diaduk dan dibiarkan selama ± 1 malam. Hasil maserasi disaring dengan kertas saring dan diperoleh
filtrat. Residu yang ada direndam kembali dengan pelarut n-heksan. Hal ini dilakukan secara berulang hingga diperoleh filtrat jernih. Kemudian filtrat yang
diperoleh dipisahkan dengan rotavapor sehingga dihasilkan ekstrak kental. Ekstrak kental yang telah dirotavapor di tempatkan ke dalam beaker glass
dan ditutup dengan alumunium foil, lalu dimasukkan ke dalam freezer untuk mencegah kerusakan ekstrak. Ekstrak andaliman tidak larut dalam air, maka untuk
mendapat campuran yang homogen digunakan suatu pelarut yaitu carboxyl metil cellulosa CMC dengan konsentrasi 1 1 mL CMC dilarutkan dalam 100 mL
aquadest sehingga dihasilkan ekstrak yang diinginkan. Lalu dibuat dosis yang telah dimodifikasi dengan cara melarutkan ekstrak buah andaliman 2 dalam 1
CMC, 4 dilarutkan dalam 1 CMC, dan 6 dilarutkan dalam 1 CMC Chairul et al., 1992; Pratiwi, 2006.
3.3.2 Persiapan Hewan Uji
Penelitian ini menggunakan mencit betina Mus musculus L. strain DDW. Disediakan satu ekor mencit jantan lalu ditempatkan dalam kandang yang berisi
enam ekor mencit betina yang sedang estrus selama satu malam. Sumbat vagina menyatakan telah terjadi kopulasi atau perkawinan mencit antara mencit jantan
dan mencit betina dan ditetapkan sebagai hari ke-0 nol kebuntingan Taylor, 1986. Mencit yang bunting dipisahkan dan dipelihara sampai melahirkan. Anak
Universitas Sumatera Utara
mencit yang berumur ± tiga minggu dipisahkan dari induknya dan dipelihara dalam kandang terpisah dengan memisahkan antara mencit jantan dan betina.
Kandang yang terbuat dari plastik yang diberi alas sekam yang dilakukan pergantian sekam dua kali seminggu. Pemberian pakan dan minum dilakukan
setiap hari secara ad-libitum Sabri et al, 2007. Mencit betina yang sudah berumur ± 12 minggu dengan kisaran berat badan ± 25-30 g kemudian
dikawinkan dengan mencit jantan. Apabila terjadi sumbat vagina pada mencit betina maka dinyatakan sebagai hari ke-0 nol kebuntingan Taylor, 1986.
Mencit yang bunting dari perkawinan tersebut siap untuk diberi perlakuan.
3.3.3 Pemberian Perlakuan
Pemberian bahan uji dilakukan pada mencit betina Mus musculus L. yang sedang bunting dengan menggunakan jarum gavage Hrapkiewicz
Medina, 2007. Pemberian dilakukan selama 10 hari kebuntingan. Volume pemberian ekstrak sebanyak 0,3 mlekorhari. Kemudian mencit dibunuh dengan
cara dislokasi leher pada saat mencapai 18 hari kebuntingan. Selanjutnya mencit dibedah, diambil organ ginjal dan dicuci dalam larutan fisiologis NaCl 0,9 lalu
ditimbang, setelah itu dimasukkan ke dalam larutan Bouin.
3.3.4 Rancangan Penelitian Tabel 3.3.4 Model Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dengan rancangan acak lengkap RAL. Pada penelitian ini jumlah sampel yang digunakan adalah sebanyak 30
Perlakuan Konsentrasi
Lama Waktu Pemberian
Jumlah Mencit
Kontrol P0 -
- 6 ekor
Kontrol Pelarut P1 CMC 1
10 hari kebuntingan 6 ekor
Perlakuan P2 2
10 hari kebuntingan 6 ekor
Perlakuan P3 4
10 hari kebuntingan 6 ekor
Perlakuan P4 6
10 hari kebuntingan 6 ekor
Universitas Sumatera Utara
ekor mencit strain DDW yang memenuhi kriteria inklusi, yaitu umur 2-3 bulan, berat badan 25-30 g, dan tidak terdapat abnormalitas anatomi yang tampak.
Setelah mengalami masa adaptasi selama 1 minggu, sampel secara random dibagi menjadi lima kelompok yang terdiri atas kelompok kontrol, kelompok kontrol
pelarut dan 3 kelompok perlakuan. Kelompok P0 kontrol mendapatkan pakan standar dan minum berupa air
ledeng secara ad-libitum. Kelompok Kontrol Pelarut P1 diberi pakan standar dan CMC 1. Sedangkan kelompok perlakuan P2, P3, P4 masing-masing diberi
pakan standar, air ledeng dan ekstrak N-heksan andaliman dengan konsentrasi 2, 4, dan 6. Setelah perlakuan, pada hari kedelapan belas mencit dibunuh
dengan cara dislokasi leher, kemudian diambil organ ginjalnya, dicuci dengan larutan NaCl 0,9 lalu difiksasi dengan Bouin dan diproses mengikuti metode
parafin dengan pewarnaan HE. Dari setiap organ diamati di bawah mikroskop dalam 5 lapangan pandang, yaitu pada keempat sudut dan bagian tengah preparat,
dengan perbesaran 400x. Sasaran yang dibaca adalah tubulus proksimal ginjal. Penghitungan kerusakan tubulus proksimal menggunakan rumus nm x
100, dimana n adalah jumlah tubulus proksimal yang telah menutup dalam satu lapangan pandang sedangkan m adalah jumlah seluruh tubulus proksimal yang
terdapat dalam satu lapangan pandang Sihardo, 2006.
3.3.5 Penimbangan Berat Ginjal
Setelah mendapat perlakuan mencit didislokasi kemudian dibedah. Diambil salah satu ginjal secara acak. Organ ginjal diambil dan ditimbang pada timbangan
elektronik.
3.3.6 Pembuatan Preparat Ginjal dengan Metode Parafin
Mencit Mus musculus L. didislokasi dan dibedah. Diambil organ ginjal, ditimbang dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9 kemudian difiksasi selama
seminggu dengan larutan Bouin. Setelah difiksasi, ginjal dicuci dengan alkohol 70 dengan cara dishaker sampai benar-benar jernih dan direndam dengan
Universitas Sumatera Utara
alkohol 70 selama 1 malam. Setelah direndam semalaman dilakuan dehidrasi dengan merendam organ ginjal sambil dishaker dengan menggunakan alkohol
bertingkat, yaitu dari alkohol 70, 80, 96 dan 100 absolut selama 1 jam pada masing-masing konsentrasi. Setelah itu organ ginjal direndam di dalam
xylol selama 1 malam. Organ ginjal yang telah direndam 1 malam di dalam xylol kemudian diambil dan direndam dalam xylol lagi selama 1 jam pada suhu kamar,
lalu dipindahkan lagi ke dalam xylol yang baru selama 1 jam. Setelah itu organ ginjal direndam ke dalam parafin murni I, parafin murni II, dan parafin murni III
masing-masing selama 1 jam pada suhu 60°C. Setelah melewati tahap-tahap tersebut barulah memasuki tahap embedding
atau penanaman organ ke dalam parafin. Parafin baru yang telah cair dituang ke dalam kotak yang telah disediakan, kemudian ginjal ditanam dalam kotak yang
telah berisi parafin dan diatur posisinya lalu diberi label. Dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin. Blok-blok tersebut selanjutnya dirapikan pada
holder yang terbuat dari kayu berukuran 3x2x3 cm yang berbentuk balok. Setelah itu dilakukan pemotongan atau cutting dengan memotong blok-blok parafin yang
telah diholder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6 µm. Kemudian dilakukan penempelan, yaitu dengan
mengambil beberapa pita parafin, kemudian diletakkan pada object glass, dan dicelupkan pada air dingin dan kemudian pada air hangat. Lalu diletakkan di atas
hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada object glass. Setelah tahap ini selesai barulah memasuki tahap pewarnaan. Object glass dicelupkan
pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama 5 menit. Lalu ke dalam alkohol bertingkat dengan konsentrasi menurun, yaitu dari alkohol absolut, 96, 80,
70, 60, 50, 40, 30 kemudian ke dalam aquadest. Dimana masing- masing konsentrasi dicelupkan ± 3-5 detik.
Setelah itu, sediaan dimasukkan ke dalam larutan pewarna hematoksilin selama beberapa detik, lalu dicuci dengan air mengalir, kemudian dimasukkan ke
dalam alkohol 30, 40 , 50, 60 , dan 70, lalu dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin selama beberapa detik, dilanjutkan ke dalam alkohol 80,,
90, dan alkohol absolute. Setelah itu, dilap dengan kertas tisu dan dimasukkan ke xylol selama ± 2 menit. Preparat dikeringkan dan dibersihkan dengan kertas
Universitas Sumatera Utara
tisu. Kemudian preparat diberi canada balsam agar awet dan melekat pada cover glass, diusahakan agar tidak terdapat gelembung udara saat menutup preparat
dengan cover glass. Preparat yang telah diwarnai kemudian diberi label dan diamati kerusakannya khususnya pada tubulus proksimal di bawah mikroskop.
3.4 Parameter Pengamatan 3.4.1 Berat Ginjal
Pengamatan berat ginjal dilakukan dengan cara menimbang organ ginjal mencit betina pada timbangan elektronik. Dari satu ekor mencit betina diambil
satu organ ginjal. Ginjal dipilih secara acak tanpa membedakan antara ginjal kiri dan kanan. Berat ginjal dari ke enam ekor mencit pada tiap perlakuan kemudian
dirata-ratakan dan dicatat hasilnya hingga diperoleh data.
3.4.2 Kerusakan Tubulus Proksimal Ginjal
Preparat ginjal dibuat dengan metode blok parafin dengan pewarnaan HE. Dari setiap organ ginjal yang diambil, dibuat dua preparat kemudian dilakukan
pengamatan. Setiap preparat diamati di bawah mikroskop dalam 5 lapangan pandang, yaitu dengan menggeser preparat ke kiri atas, kiri bawah, tengah, kanan
atas, dan kanan bawah dengan perbesaran 400x. Sasaran yang dibaca adalah tubulus proksimal ginjal yang mengalami kerusakan berupa edema atau
pembengkakan hingga lumen menutup. Pada setiap lapangan pandang dihitung jumlah tubulus proksimal yang rusak, kemudian dirata-ratakan dan dihitung
persentase kerusakannya lalu dicatatat pada buku data.
3.4.3 Diameter Tubulus Proksimal yang Menutup
Tubulus proksimal yang menutup dari setiap preparat dipilih secara acak sebanyak 20 buah, kemudian diukur diameternya. Ukuran diameter yang
diperoleh dirata-ratakan dan dicatat pada buku data.
Universitas Sumatera Utara
3.5 Analisis Statistik
Data yang didapat dari setiap parameter variabel pengamatan, yaitu berat ginjal, penutupan tubulus proksimal, dan diameter tubulus proksimal yang
menutup dicatat dan disusun ke dalam bentuk tabel. Data kuantitatif variabel dependen yang didapatkan yaitu rerata dan standart deviasi dari berat ginjal,
penutupan tubulus proksimal, dan diameter tubulus proksimal yang menutup diuji dengan bantuan progr statistik komputer yakni progr SPSS release 16. Urutan uji
diawali dengan uji normalitas dan uji homogenitas. Apabila data yang diperoleh homogen dan normal p0,05 maka dilanjutkan dengan uji sidik ragam
ANOVA, jika berbeda nyata p0,05 maka dilanjutkan dengan uji Post Hoc- Bonferroni. Tetapi apabila hasil uji homogenitas dan normalitas menunjukkan
tidak homogen atau tidak normal, maka data tersebut ditransformasi sebanyak 3 kali. Apabila tetap tidak homogen atau tidak normal p0,05 maka dilanjutkan
dengan uji non parametrik Kruskal-Wallis. Setelah itu untuk melihat perbedaan antara 2 perlakuan kontrol dan ekstrak andaliman dilakukan uji Mann-Whitney
Prakoso, 2008.
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Berat Ginjal Mencit
Hasil pengamatan terhadap berat ginjal mencit betina hamil dengan perlakuan ekstrak n-heksan buah andaliman dengan perbedaan konsentrasi telah
dilakukan uji analisis statistik Dari data tersebut diperoleh bahwa rata-rata berat ginjal mencit yang diberi perlakuan ekstrak n-heksan buah andaliman terjadi
penurunan bila dibandingkan dengan kontrol blank P0 dan kontrol pelarut P1. Rata-rata berat ginjal mencit pada P0 0,260 g dan P1 0,250 g. Sedangkan rata-
rata berat ginjal mencit pada P2 0,230 g, pada P3 0,220 g, dan pada P4 0,218 g. Grafiknya dapat dilihat pada Gambar 4.1.1
Gambar 4.1. Berat Ginjal Mencit yang diberi ekstrak n-heksan buah andaliman pada konsentrasi yang berbeda. P0
= Kontrol Blank mencit tidak diberi perlakuan apapun selain pakan; P1 = Kontrol
Pelarut pemberian CMC 1; P2, P3 dan P4= Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak N-heksan buah andaliman 2, 4, dan 6;
huruf yang berbeda pada perlakuan berbeda menunjukkan berbeda nyata; satuan dalam gram g.
a a
ab b
b
Universitas Sumatera Utara
Kategori