pelusida dan untuk membuktikan bahan pembasuh embrio yang paling efektif untuk menghilangkan cemaran bakteri
E.coli K99 pada embrio.
5.2 MATERI DAN METODE 5.2.1. Superovulasi dan panen embrio
Cara melakukan superovulasi terhadap mencit betina dewasa dan pemanenan embrio, sama dengan yang dilakukan pada 4.2.1. Begitu pula
mengenai hewan mencit yang dipakai dan bahan-bahan yang digunakan sama jenisnya. Pada eksperimen ini embrio yang dicemari dengan bakteri
E.coli K99 dan setelah diinkubasi agar terjadi proses perlekatan, kemudian dibasuh dengan
tiga perlakuan berbeda yakni: mPBS; mPBS mengandung tripsin; atau mPBS mengandung pronase. Pengamatan terhadap embrio dalam kultur in vitro
dilakukan setiap enam jam selama 48 jam, untuk mengamati akibat pembasuhan embrio tercemar terhadap daya eliminasi pembasuh serta akibatnya terhadap
perkembangan embrio.
5.2.2 Penyiapan bakteri E.coli K99
Bakteri E.coli diperoleh dari Balai Penelitian Veteriner Balitvet Bogor.
Bakteri E.coli O9 K99 tersebut diisolasi dari anak sapi. Isolat E.coli dibiakkan
semalam dalam media agar Minca plus vitox Oxoid, UK pada cawan petri.
Setelah inokulasi selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37 C selama satu malam.
Pada suhu tersebut antigen K99 lebih banyak diproduksi dibandingkan dengan suhu dibawah 25
C Guinee et al. 1977. Setelah diinkubasi, sel-sel bakteri pada
permukaan agar dibilas dengan NaCl fisiologis steril, kemudian sel-sel itu dicuci tiga kali. Sel-sel dipisahkan dengan sentrifugasi 4000 rpm selama 20 menit.
Endapan sel dari pencucian terakhir kemudian dibuat suspensi dengan kekeruhan setara dengan tabung standar Mc Farland nomor 10 Supar 1986.
5.2.3 Pencemaran embrio dengan E.coli K99
Embrio mencit tahap delapan sel atau morula sebanyak 69 embrio dibagi kedalam tiga kelompok perlakuan. Sebelum dibagi dalam kelompok embrio
tersebut dicemari dengan bakteri E.coli K99 dalam mPBS yang mengandung
bakteri 10
3
CFUml dan kemudian diinkubasi selama satu jam dalam inkubator 37
C. Setelah dicemari dengan bakteri, kelompok I yang terdiri dari 23 embrio, dibasuh dengan cara memindahkan embrio yang ditempatkan dalam tetesan
drop mPBS pertama ke enam tetes mPBS yang lain dan selanjutnya ke tiga tetes KSOM, dalam satu cawan petri plastik 35 mm yang steril. Larutan mPBS
yang dipakai tidak mengandung antibiotik. Embrio tersebut dipindahkan dari tetesan mPBS 50µl ke tetesan lainnya menggunakan mikropipet steril. Embrio
kelompok II perlakuan dengan tripsin, setelah dicemari dengan bakteri E.coli
K99, dimasukan ke dalam tetesan 50µl medium mPBS yang mengandung tripsin 0,1 Trypsin, Sigma, St.Louis, dan ditempatkan dalam tetesan tersebut
selama 90 detik. Selanjutnya embrio tersebut dicuci dengan memindahkannya dalam tetesan-tetesan medium mPBS tanpa antibiotik, sebanyak enam kali dan
empat kali pada tetesan-tetesan KSOM kalium simplex optimized medium.
Embrio kelompok III perlakuan dengan pronase, setelah dicemari dengan bakteri langsung dimasukan kedalam tetes mPBS 50µl yang mengandung
pronase 0,25 Protease, Sigma, St.Louis. Embrio-embrio tersebut berada dalam larutan pronase selama sekitar 60 detik yang sebelumnya dihangatkan
hingga ±37 C Vanroose 1999 dan sambil diamati di bawah mikroskop binokuler,
untuk memantau agar jangan sampai zona pelusida meluruh secara keseluruhan akibat kerja enzim pronase yang berlebih-lebihan. Setelah itu dibasuh dalam
mPBS sebanyak enam kali dan pada tetesan KSOM sebanyak empat kali. Seluruh embrio perlakuan yang telah dicuci tersebut selanjutnya
dipidahbiakkan dalam medium KSOM tanpa antibiotik. Ke dalam setiap tetesan medium 13µl dimasukan paling banyak lima embrio perlakuan. Tetesan-
tetesan medium KSOM disiapkan dalam petri plasltik 35 mm steril, kemudian ditutupi dengan
mineral oil. Embrio ini dimasukan kedalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37
C, selama 48 jam.
5.2.4 Rancangan percobaan
