diinkubasikan dalam inkubator CO
2
5 pada suhu 37 C. Selama enam jam,
perkembangannya atau reexpansion dari blastosis, diamati seperti pada evaluasi
blastosis hasil warming sebelum dilakukan transfer embrio Lane et al. 1999:
Takahashi et al. 2005.
6.2.5. Viabilitas daya tahan hidup embrio sesudah vitrifikasi
Setelah warming, embrio yang ditemukan ditempatkan pada cawan petri
yang telah berisi tetesan-tetesan medium KSOM dengan volume sekitar 13µl, ditutupi dengan minyak mineral, dan dinkubasikan dalam inkubator CO
2
5 dengan suhu 37
C Lieberman Tucker 2002. Pengamatan dilakukan setiap enam jam dalam periode 48 jam dengan mikroskop
inverted Olympus IX70 Japan. Daya tahan hidup embrio dinilai berdasarkan 1 keutuhan morfologi; 2
reekspansi blastosul; dan 3 perkembangan embrio ke tahap lebih lanjut Takahashi
et al. 2005.
6.2.6. Pewarnaan vital
Sel embrio hidup dan sel embrio mati dari blastosis pasca vitrifikasi diamati dengan pewarnaan vital menggunakan
bisbenzimide H-33342 dan propidium iodine. Sebanyak 10µg propidium iodine dan sediaan bisbenzimide
dalam jumlah yang sama dilarutkan dalam 1000µl mPBS Saha et al. 2000.
Campuran tersebut ditambah 20 serum. Sebanyak 30µl larutan pewarna tersebut diteteskan ke atas gelas objek, kemudian blastosis dimasukkan ke
tetesan pewarna tersebut. Blastosis dibiarkan dalam pewarna tersebut selama 15 menit dalam suasana ruang gelap. Sediaan blastosis dalam zat warna pada
gelas objek tersebut ditutup dengan gelas tutup kemudian diperiksa di bawah mikroskop flouresens Nikon-Eclipse E600, Japan. Sel embrio yang hidup
terwarnai menjadi berwarna biru berpendar, dan sel embrio yang mati berwarna merah berpendar.
6.2.7. Penyiapan bakteri dan pemaparan embrio terhadap bakteri E.coli K99
Bakteri E.coli diperoleh dari Balai Penelitian Veteriner Balitvet Bogor.
Bakteri E.coli O9 K99 diisolasi dari anak sapi asal Sukabumi Jawa Barat Supar
1986. Isolat E.coli dibiakkan semalam pada media agar Minca plus vitox
Oxoid, UK yang disiapkan pada cawan petri. Setelah inokulasi selanjutnya diinkubasikan pada suhu 37
C selama satu malam Guinee et al. 1977. Setelah
inkubasi, sel-sel bakteri pada permukaan agar dibilas dengan NaCl fisiologis. Sel-sel itu dicuci tiga kali dengan NaCl fisiologis steril untuk menghilangkan sisa-
sisa medium. Sel-sel dipisahkan dengan sentrifugasi 4000 rpm selama 20 menit. Endapan sel dari pencucian terakhir kemudian dibuat suspensi dengan
kekeruhan setara dengan tabung standar Mc Farland nomor 10 Supar 1986. Sekelompok embrio tahap blastosis yang memiliki zona pelusida utuh
ditempatkan pada 80µl medium mPBS 3 dan diberi bakteri E.coli K99 dengan
konsentrasi bakteri 10
5
CFUml. Setelah itu biakan embrio diinkubasi dalam inkubator selama satu jam pada suhu 37
C. Embrio yang terpapar bakteri kemudian divitrifikasi menurut metode yang dikembangkan oleh Lane
et al. 1999.
6.2.8. Rancangan percobaan
