Alat-alat Bahan-bahan Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit- Pembuatan ekstrak Etanol Daun Pegagan

16

3.1 Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil, blender Panasonic ® , lemari pengering, mikroskop Olympus ® , hot plate Fisons ® , oven listrik Memmert ® , tanur Nabertherm ® timbangan digital Mettler Tolledo ® , seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, eksikator, cawan porselin, cawan alas datar, mortir, stamfer, objek glass , rotary evaporator Hooke D ® , timbangan hewan, oral sonde, stopwatch, spuit 1 ml, alat pengukur kadar asam urat Easy touch ® .

3.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu simplisia daun pegagan Centella asiatica L. Urb . , etanol 70 , kloral hidrat, potassium oxonate Sigma Aldrich ® , allopurinol Hexpharm ® , aquades, aqua pro injeksi, CMC Na dan pakan ternak.

3.3 Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit-

jantan, berat badan 24 g – 30 g, umur 2 - 3 bulan sebanyak 25 ekor. Hewan diaklimatisasi selama 2 minggu dengan tujuan untuk menyeragamkan makanan dan hidupnya dengan kondisi yang serba sama sehingga dianggap memenuhi syarat penelitian. 3.4 Penyiapan bahan 3.4.1 Pengumpulan bahan Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang Universitas Sumatera Utara 17 digunakan adalah daun pegagan hijau dan segar yang diambil di halaman Fakultas Hukum Universitas Sumatera Utara . 3.4.2 Identifikasi tumbuhan Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi Bogor.

3.4.3 Pembuatan simplisia

Pembuatan simplisia dilakukan dengan cara daun pegagan yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari pengotor, lalu dicuci bersih dengan air sampai bersih dan ditiriskan. Selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan terlebih dahulu, lalu dikeringkan di dalam lemari pengering sampai simplisia rapuh ketika diremas. Selanjutnya diblender sampai menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah tertutup rapat.

3.5 Pemeriksaan karakteristik simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu tidak larut asam, penetapan kadar sari larut dalam air, dan penetapan kadar sari larut dalam etanol. 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada daun pegagan segar meliputi pemeriksaan bentuk dan warna.

3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik

Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun pegagan. Caranya, yaitu pada kaca objek ditetesi dengan kloral hidrat, kemudian Universitas Sumatera Utara 18 ditambahkan sedikit serbuk simplisia daun pegagan dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop.

3.5.3 Penetapan kadar air

Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung penyambung dan tabung penerima. Cara penetapannya yaitu: Pada labu bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air di dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian kedalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia daun pegagan yang telah ditimbang saksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes per detik hingga sebagian air tersuling. Kemudian kecepatan dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Kemudian setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Depkes RI, 1995.

3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia daun pegagan, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan Universitas Sumatera Utara 19 penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol Sebanyak 5 g serbuk simplisia daun pegagan, dimaserasi selam 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.6 Penetapan kadar abu total Sebanyak 2 g serbuk simplisia daun pegagan yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porcelin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600 o C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995. 3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan Depkes RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 20

3.6 Skrining fitokimia

Pemeriksaan alkaloid, saponin Depkes RI, 1995, flavonoid dan tannin Fansworth, 1966, steroidtriterpenoid Harborne, 1987.

3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid

Serbuk simplisia daun pegagan ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Mayer akan terbentuk endapan bewarna putih atau kuning b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Bouchardat akan terbentuk endapan bewarna coklat hitam c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Dragendorff akan terbentuk endapan bewarna merah atau jingga. Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan diatas.

3.6.2 Pemeriksaan flavonoid

Sebanyak 10 g serbuk simplisia daun pegagan ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. Universitas Sumatera Utara 21

3.6.3 Pemeriksaan Tannin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun pegagan disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Terbentuk warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin.

3.6.4 Pemeriksaan Saponin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun pegagan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk buih setinggi 1-10 cm yang mantap tidak kurang dari 10 menit dan pada penambahan 1 tetes larutan asam klorida 2 N, buih tidak hilang, menunjukkan adanya saponin.

3.6.5 Pemeriksaan SteroidTriterpenoida

Sejumlah 1 g serbuk simplisia daun pegagan dimaserasi dengan 20 ml n - heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Diteteskan pada saat akan akan mereaksikan sampel uji. Timbul warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroid-triterpenoid.

3.7 Pembuatan ekstrak Etanol Daun Pegagan

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode maserasi, sesuai dengan yang tertera dalam Farmakope Indonesia 1979. Prosedurnya adalah sebagai berikut : Sebanyak 300 gram serbuk simplisia daun pegagan dimaserasi dengan 75 bagian etanol 70 dalam wadah tertutup rapat. Selanjutnya dibiarkan selama 5 hari Universitas Sumatera Utara 22 terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk, kemudian disaring dan ampas dimaserasi kembali dengan etanol 70 secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator pada temperatur ± 40 o C sampai diperoleh ekstrak kental. 3.8 Prosedur Uji Efek Penurunan Kadar Asam Urat 3.8.1 Pembuatan CMC Na 1 sebagai kontrol negatif