16
3.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, aluminium foil, blender
Panasonic
®
, lemari pengering, mikroskop
Olympus
®
, hot plate
Fisons
®
, oven listrik
Memmert
®
, tanur
Nabertherm
®
timbangan digital
Mettler Tolledo
®
, seperangkat alat destilasi penetapan kadar air, eksikator, cawan porselin, cawan alas datar, mortir, stamfer,
objek glass
, rotary evaporator
Hooke D
®
, timbangan hewan, oral sonde, stopwatch, spuit 1 ml, alat pengukur kadar asam urat
Easy touch
®
.
3.2 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu simplisia daun pegagan
Centella asiatica
L. Urb
.
, etanol 70 , kloral hidrat,
potassium oxonate
Sigma Aldrich
®
, allopurinol
Hexpharm
®
, aquades, aqua pro injeksi,
CMC Na dan pakan ternak.
3.3 Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit-
jantan, berat badan 24 g – 30 g, umur 2 - 3 bulan sebanyak 25 ekor. Hewan
diaklimatisasi selama 2 minggu dengan tujuan untuk menyeragamkan makanan dan hidupnya dengan kondisi yang serba sama sehingga dianggap memenuhi syarat
penelitian.
3.4 Penyiapan bahan 3.4.1 Pengumpulan bahan
Pengambilan sampel
dilakukan secara
purposif yaitu
tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel yang
Universitas Sumatera Utara
17 digunakan adalah daun pegagan hijau dan segar yang diambil di halaman Fakultas
Hukum Universitas Sumatera Utara . 3.4.2 Identifikasi tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan oleh Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi Bogor.
3.4.3 Pembuatan simplisia
Pembuatan simplisia dilakukan dengan cara daun pegagan yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari pengotor, lalu dicuci bersih dengan air sampai
bersih dan ditiriskan. Selanjutnya dikeringkan dengan cara diangin-anginkan terlebih dahulu, lalu dikeringkan di dalam lemari pengering sampai simplisia rapuh
ketika diremas. Selanjutnya diblender sampai menjadi serbuk dan disimpan dalam wadah tertutup rapat.
3.5 Pemeriksaan karakteristik simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu total, penetapan kadar abu
tidak larut asam, penetapan kadar sari larut dalam air, dan penetapan kadar sari
larut dalam etanol. 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan pada daun pegagan segar meliputi pemeriksaan bentuk dan warna.
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia daun pegagan. Caranya, yaitu pada kaca objek ditetesi dengan kloral hidrat, kemudian
Universitas Sumatera Utara
18 ditambahkan sedikit serbuk simplisia daun pegagan dan ditutup dengan kaca
penutup, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop.
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima. Cara penetapannya yaitu:
Pada labu bulat dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling, didestilasi selama 2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian
volume air di dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian kedalam labu yang berisi toluen jenuh tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia
daun pegagan yang telah ditimbang saksama, lalu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluen mulai mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes
per detik hingga sebagian air tersuling. Kemudian kecepatan dinaikkan hingga 4 tetes per detik. Kemudian setelah semua air tersuling, bagian dalam pendingin
dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin sampai suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah
sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang
diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen Depkes RI, 1995.
3.5.4 Penetapan kadar sari larut dalam air
Sebanyak 5 g serbuk simplisia daun pegagan, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan
Universitas Sumatera Utara
19 penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada
suhu 105 C sampai bobot tetap. Kadar sari larut dalam air dihitung terhadap bahan
yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.5 Penetapan kadar sari larut dalam etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia daun pegagan, dimaserasi selam 24 jam dalam 100 ml etanol 95 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6
jam pertama, dibiarkan selama 18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan
ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar sari larut
dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes RI, 1995. 3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk simplisia daun pegagan yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porcelin yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan di udara Depkes RI, 1995. 3.5.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan kadar abu total dididihkan dengan 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam
asam dikumpulkan, disaring dengan kertas saring, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu yang tidak larut dalam
asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan Depkes RI, 1995.
Universitas Sumatera Utara
20
3.6 Skrining fitokimia
Pemeriksaan alkaloid, saponin Depkes RI, 1995, flavonoid dan tannin Fansworth, 1966, steroidtriterpenoid Harborne, 1987.
3.6.1 Pemeriksaan Alkaloid
Serbuk simplisia daun pegagan ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9
ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan lalu
disaring. Filtrat dipakai untuk percobaan berikut:
a. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Mayer akan terbentuk endapan bewarna putih atau kuning
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Bouchardat akan terbentuk endapan bewarna coklat hitam
c. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes larutan Dragendorff akan terbentuk endapan bewarna merah atau jingga.
Alkaloida dinyatakan positif jika terjadi endapan atau paling sedikit dua atau tiga dari percobaan diatas.
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia daun pegagan ditambahkan 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas, ke dalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoid positif jika terjadi warna
merah atau kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol.
Universitas Sumatera Utara
21
3.6.3 Pemeriksaan Tannin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun pegagan disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna.
Diambil 2 ml larutan lalu ditambahkan 1 - 2 tetes pereaksi besi III klorida 1 . Terbentuk warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tannin.
3.6.4 Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun pegagan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan kemudian
dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Jika terbentuk buih setinggi 1-10 cm yang mantap tidak kurang dari 10 menit dan pada penambahan 1 tetes larutan asam
klorida 2 N, buih tidak hilang, menunjukkan adanya saponin.
3.6.5 Pemeriksaan SteroidTriterpenoida
Sejumlah 1 g serbuk simplisia daun pegagan dimaserasi dengan 20 ml
n
- heksana selama 2 jam, lalu disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada
sisa dalam cawan penguap ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Diteteskan pada saat akan akan mereaksikan sampel uji. Timbul
warna ungu atau merah kemudian berubah menjadi hijau biru menunjukkan adanya steroid-triterpenoid.
3.7 Pembuatan ekstrak Etanol Daun Pegagan
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini yaitu metode maserasi, sesuai dengan yang tertera dalam Farmakope Indonesia 1979.
Prosedurnya adalah sebagai berikut : Sebanyak 300 gram serbuk simplisia daun pegagan dimaserasi dengan 75
bagian etanol 70 dalam wadah tertutup rapat. Selanjutnya dibiarkan selama 5 hari
Universitas Sumatera Utara
22 terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk, kemudian disaring dan ampas
dimaserasi kembali dengan etanol 70 secukupnya hingga diperoleh 100 bagian. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan
rotary evaporator
pada temperatur ± 40
o
C sampai diperoleh ekstrak kental.
3.8 Prosedur Uji Efek Penurunan Kadar Asam Urat 3.8.1 Pembuatan CMC Na 1 sebagai kontrol negatif