Penetapan aktivitas baku vitamin A

Untuk mendapatkan kondisi analisis optimum vitamin A dalam minyak goreng sawit, beberapa parameter kondisi KCKT perlu dioptimasi antara lain: komposisi fase gerak, laju alir fase gerak dan detektor yang digunakan. Komposisi fase gerak dan laju alir yang optimum memberikan jumlah lempeng teoritis N yang besar, resolusi Rs yang lebih besar dari 1,5, faktor ikutan Tf yang mendekati satu, serta waktu retensi yang relatif singkat, sedangkan optimasi detektor yang digunakan untuk menentukan spesifisitas dan selektivitas yang tinggi dalam analisis tanpa adanya gangguan dari matriks sampel. Dalam penelitian ini digunakan kolom C18 yang bersifat non polar, sehingga sistem kromotagrafi ini merupakan sistem kromatografi fase balik. Daya elusi dalam sistem kromatografi ini berbanding terbalik dengan polaritas fase gerak. Semakin kecil polaritas fase gerak, maka daya elusinya semakin besar. Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari fase gerak berupa pelarut murni asetonitril atau metanol dan campuran pelarut organik asetonitril atau metanol dengan air. Dalam hal ini, air merupakan senyawa yang paling polar bila dibandingkan dengan asetonitril dan metanol. Apabila jumlah air dalam komposisi fase gerak tersebut ditambah, maka daya elusinya semakin rendah dan akibatnya waktu retensi analit semakin besar. Namun dengan berkurangnya daya elusi dapat memperbaiki bentuk kromatogram tersebut resolusi, jumlah lempeng teoritis ataupun tailing faktor hingga diperoleh kondisi yang optimum. Pada pencarian kondisi analisis optimum, laju alir juga divariasikan mulai dari 0,6 mLmenit sampai dengan 1,75 mLmenit. Laju alir berbanding lurus dengan waktu retensi. Pada optimasi laju alir dipilih yang mempunyai waktu terpendek tetapi tidak mengabaikan kapasitasnya. Waktu retensi dikendalikan oleh koefesien distribusi k, jika harga k besar maka komponen dalam fase diam lebih besar dari pada dalam fase gerak, sehingga komponen akan tinggal lebih lama dalam fase diam. Kecepatan migrasi ditentukan oleh jumlah komponen yang terdapat dalam fase gerak, karena komponen hanya bergerak dibawa oleh fase gerak, sedangkan laju alir mempengaruhi migrasi suatu komponen. Untuk fase gerak yang viskositasnya besar akan menyebabkan peningkatan tekanan pada kolam, sehingga bila menggunakan fase gerak dengan menggunakan pelarut yang mempunyai viskositas yang besar, maka laju alirnya tidak boleh besar. Dalam hal ini, asetonitril merupakan pelarut yang mempunyai viskositas paling kecil bila dibandingkan denga air dan metanol. Dalam hal ini, bila komposisi fase gerak terdiri dari asetonitril dengan jumlah yang besar maka dalam analisis bila menggunakan laju alir yang besar tekanan kolom tetap rendah. Pada pencarian kondisi analisis optimum, detektor yang digunakan juga divariasikan. Detektor yang digunakan pada penelitian ini adalah detektor ultraviolet dan detektor fluoresens. Detektor ultraviolet digunakan untuk mendeteksi komponen zat yang dapat menyerap cahaya di daerah ultraviolet 190 – 400 nm. Keuntungan dari detektor ini adalah pemilihan panjang gelombang yang luas dan sensitivitas terhadap alat yang baik. Detektor fluoresens digunakan untuk mendeteksi komponen zat yang dapat menyerap cahaya dan kemudian memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang lebih tinggi. Dibandingkan dengan detektor ultra violet, detektor flouresen lebih peka dan lebih selektif, karena hanya komponen zat yang berfluoresensi saja yang dapat dideteksi. Vitamin A dapat dideteksi baik dengan menggunakan detektor ultraviolet maupun menggunakan detektor fluoresens. Pada penelitian ini digunakan kolom C 18 Waters Xbridge, dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µ m. Pemilihan kondisi optimum dilakukan dengan memvariasikn komposisi fase gerak, laju alir dan detektor yang digunakan detektor ultraviolet dan fluoresens. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan komposisi fase gerak metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 9, sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 10. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 11, sedangkan data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak metanol dan air dengan detektor fluoresens dapat dilihat pada Tabel 12. Data pengamatan kromatogram vitamin A dalam matriks minyak goreng sawit menggunakan variasi komposisi fase gerak asetonitril dan metanol dengan detektor UV dapat dilihat pada Tabel 13,