2.4 METODE ANALISIS PENETAPAN KADAR VITAMIN A
Secara umum pengujian vitamin A dalam bahan pangan terdiri atas 3 tahap yaitu: tahap saponifikasi, tahap ektraksi, tahap pemekatan atau
penguapan pelarut organik dan tahap pengukuran menggunakan instrumen. Saponifikasi dilakukan dengan menggunakan kalium hidroksida dengan
pelarut campuran etanol dan air, penambahan zat anti oksidan asam askorbat, pirogalol, butil hidroksi toluena dan pemanasan pada suhu 60–80
o
C Eitenmiller, 2008. Tahap ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut organik
seperti petroleum eter Eitenmiller, 2008; eter, campuran etanol dengan tetra hidrofuran USP Convention 2008. Selanjutnya dilakukan pemekatan atau
penguapan terhadap pelarut organik yang digunakan, lalu dilarutkan kembali dengan pelarut lainnya seperti metanol atau etanol dan selanjutnya siap untuk
ditetapkan kadarnya menggunakan instrumen seperti: spektrofotometri atau kromatografi cair kinerja tinggi. Metode penetapan kadar vitamin A
menggunakan instrumen akan dijelaskan sebagai berikut:
2.4.1 Metode Spektrofotometri
2.4.1.1 Pengukuran secara langsung. Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat
mempunyai absorbsi maksimal pada panjang gelombang antara 325 sampai 328 nm dalam berbagai pelarut. Larutan vitamin A dalam
isopropanol absorbansinya diukur pada panjang gelombang maksimal λ
maks
dan pada dua titik, yaitu satu disebelah kanan λ
maks
dan satunya pada sebelah kiri
λ
maks.
Absorbansi pada λ
maks
dikoreksi terhadap senyawa pengganggu dengan menggunakan formula koreksi karena
senyawa-senyawa ini akan ikut menyerap pada daerah UV. Beberapa pengganggu terutama pada minyak ikan adalah vitamin A
2
, kitol, anhidro vitamin A dan asam polien. Pada vitamin A sintetik senyawa
pengganggunya adalah senyawa-senyawa antara Rohman dan Sumantri, 2007.
2.4.1.2 Pengubahan retinol atau akseroftol menjadi anhidroakseroftol Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan
bantuan sejumlah kecil asam mineral atau asam organik kuat. Metode Budowski dan Bondi, akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol
dalam pelarut benzen dengan katalisator asam toluen-p-sulfonat pada temperatur kamar. Kenaikan absorbansi pada 399 nm merupakan hasil
dehidrasi yang berbanding langsung dengan jumlah akseroftol yang terkandung. Reaksi ini dapat dihentikan dengan penambahan alkali.
Pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm dan 399 nm dalam benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian
akseroftol yakni dengan melihat bahwa A
399 nm
A
377 nm
sebesar 0,868 dan A
358 nm
A
377 nm
sebesar 0,692 Rohman dan Sumantri, 2007. 2.4.1.3 Metode Maleat anhidrat untuk isomer vitamin A
Maleat anhidrat bereaksi dengan all-trans dan 9-cis isomer vitamin A menghasilkan senyawa yang tidak memberikan warna biru
ketika diuji dengan menggunakan antimon III klorida. Potensi kehilangan terhadap all-trans dan 9-cis isomer dapat terjadi, sehingga
perlu dilakukan dua kali pengukuran nilai antimon III klorida, pertama untuk isomer campuran dan setelah penghilangan kedua
isomer tersebut. Dari perbedaan nilai pengukuran ini, maka komposisi isomer dalam campuran dan potensi biologisnya dapat ditentukan.
2.4.1.4 Penentuan secara simultan retinol vitamin A
1
dan dehidro- retinol vitamin A
2
Prinsip dari metode ini adalah perbedaan panjang gelombang maksimum dan nilai ekstinsi dari masing-masing vitamin A
1
dan A
2
. Vitamin A
1
mempunyai panjang gelombang maksimum pada 326 nm sedangkan vitamin A
2
mempunyai panjang gelombang maksimum pada 351 nm.
2.4.2 Metode kolorimetri
Kategori