2.4.2.4 Pengukuran dengan menggunakan Asam fosfotungstat Vitamin A dalam kloroform bereaksi dengan asam fosfotungstat
dalam etil asetat dengan adanya asetat anhidrat maka menghasilkan warna biru dan memberikan serapan maksimum pada panjang gelom-
bang 620 nm. Reaksinya mematuhi hukum Lambert-Beer. Pada pema- nasan dengan suhu 50°C menggunakan penangas air, warna biru yang
ada akan berubah menjadi biru keunguan, ungu, dan akhirnya menjadi merah dan mempunyai serapan maksimum pada 530 nm. Warna merah
yang timbul juga mematuhi hukum Lambert-Beer dan cocok untuk pengujian vitamin A, akan tetapi metode ini kurang sensitif untuk
bahan dengan kadar vitamin A rendah Libman, 1966. 2.4.2.5 Pengukuran secara kolorimetri dengan aluminium klorida
Metode ini mencakup reaksi larutan jenuh aluminium klorida dalam kloroform anhidrat dengan vitamin A. Warna yang timbul
mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 618 nm dan mematuhi hukum Lambert-Beer
Libman, 1966. 2.4.2.6 Pengukuran menggunakan asam fosfomolibdat
Metode ini melibatkan reaksi vitamin A dengan asam fosfo- molibdat; warna biru yang timbul memberikan serapan maksimum
pada panjang gelombang 700 serta mematuhi hukum Lambert-Beer Libman, 1966.
2.4.3 Metode Spektrofluorometri
Berdasarkan sifat vitamin A yang dapat memberikan flourosensi, maka vitamin A dalam bahan pangan yang telah diekstrasi dapat diu-
kur menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang eksi- tasi 330 nm dan emisi 480 nm. Pengukuran dengan metode spektro-
fluorometri lebih spesifik dibandingkan cara spektrofotometri, karena banyak senyawa yang memberikan serapan pada daerah UV, namun
tidak memberikan sifat flourosensi Angustin dkk 1985.
2.4.4 Metode Kromatografi
2.4.4.1 Pengukuran dengan kromatografi lapis tipis
Vitamin A dapat dipisahkan dengan komponen lainnya secara kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam silika gel F
254
dan fase gerak campuran siklo heksana dan eter dengan perbandingan 4:1, noda
yang telah terpisah dideteksi menggunakan asam fosfomolibdat dan bercak biru hijau yang terjadi menunjukkan adanya vitamin A.
Perkiraan harga Rf vitamin A dalam bentuk alkohol, asetat dan palmitat berturut-turut adalah 0,1; 0,45 dan 0,7 Depkes 1995
. Untuk
mendeteksi noda vitamin A dapat juga digunakan larutan antimon III klorida yang akan memberikan warna biru Depkes 1979 atau
menggunakan UV pada pada panjang gelombang 254 nm CE 2007.
Sebagai fase gerak selain menggunakan campuran siklo heksana dan
eter, juga dapat digunakan campuran siklo heksana dan etil asetat dengan perbandingan 9:1 Libman 1966.
2.4.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Vitamin A dapat ditetapkan kadarnya menggunakan KCKT
menggunakan kolom fase normal atau kolom fase terbalik. Dengan menggunakan kolom fase normal, vitamin A ditetapkan kadarnya
menggunakan fase diam kolom silika, fase gerak n-heksana dan dideteksi menggunakan UV 325-nm USP Convention 2008. Sebagai
fase gerak dapat juga digunakan campuran heptana dan diisopropil eter, 95:5; heksana dan dietil eter 98:2; 1-5 2-propanol dalam
heptana; heksana dan metil etil keton, 90:10 Nollet 2000. Dengan kolom fase terbalk, vitamin A ditetapkan kadarnya menggunakan fase
diam kolom C18, fase gerak campuran metanol dan air dengan perbandingan 860:140 dan dideteksi menggunakan UV 328-nm atau
313-nm AOAC International, 2005. Sebagai fase gerak dapat juga digunakan campuran asetonitril dengan air 90:10 Eitenmiller, 2008;
campuran asetonitril dengan air, 90:10 atau campuran metanol dengan air, 80:20 Augustin dkk 1985. Persiapan sampelnya terdiri atas
proses saponifikasi, ekstraksi, pemekatan dan melarutkan kembali menggunakan pelarut yang sesuai.
2.5 INTRUMENTASI KCKT
