41
Arbutin merupakan turunan hidrokuinon yang sering digunakan sebagai agen pencerah kulit. β-arbutin digunakan sebagai agen pencerah kulit didalam
krim kosmetik wajah atau lotio n wajah pada konsentrasi 7, 10 larutan β-
Arbutin dapat menimbulkan sedikit potensi iritasi primer Scientific Committee on Consumer Safety, 2015. Pada uji pendahulan, dilakukan uji pada siput
menggunakan arbutin dengan konsentrasi 5. Didapatkan hasil bahwa siput tidak mati dan tetap memproduksi mukus. Arbutin dibuat dengan konsentrasi 5 dalam
gel, digunakan sebagai bahan uji non iritan. Hasil uji pendahuluan untuk masing- masing bahan dapat dilihat pada Tabel VIII.
Tabel VIII. Hasil uji pendahuluan pada bahan uji
Kontrol Bahan Uji
Konsentrasi Jenis Bahan
CMC-Na 4
Non iritan Propilen glikol
8 Non Iritan
Gliserin 100
Iritan Asam salisilat
0,5 Non iritan
Asam laktat 0,5
Non iritan Sodium lauril
sulfat 1
Iritan Arbutin
5 Non Iritan
D. Slug Irritation Test
Salah satu kriteria yang diperlukan agar suatu sediaan dapat diterima dan digunakan oleh masyarakat adalah terkait keamanan. Sediaan topikal tidak boleh
bersifat iritatif terhadap kulit karena dapat mengganggu acceptance dari sediaan tersebut, sehingga perlu dilakukan uji iritasi pada bahan. Uji iritasi pada penelitian
ini menggunakan uji iritasi pada siput yang diadaptasi dari uji iritasi untuk mukosa.
42
Siput yang digunakan adalah siput telanjang rerespo yang diperoleh dari daerah Ungaran, Jawa Tengah. Dilakukan determinasi pada siput untuk
mengetahui spesies siput yang digunakan. Siput yang digunakan pada penelitian adalah siput dari spesies Laevicaulis alte FéR Lampiran 4. Jenis siput yang
digunakan untuk pengujian iritasi akan mempengaruhi hasil akhir dari uji iritasi. Dhondt et al
., 2006 menemukan bahwa “however, because this study demonstrates that the use of other slug species can influence the test end points
and eye irritation classification, it is important to evaluate the effects of the selected species
”. Masing-masing siput dan cawan petri ditimbang. Bahan uji dimasukkan
ke dalam cawan petri, siput diletakkan di atas 1 g bahan uji dalam periode waktu 60 menit dan diukur jumlah lendir diproduksi. Mukus yang dihasilkan digunakan
sebagai parameter sifat iritatif bahan. Menurut Cock et al., 2011, dalam keadaan normal siput telanjang memproduksi mukus dalam jumlah terbatas untuk
menghindari dehidrasi. Ketika siput dipaparkan dengan komponen iritan, siput akan mensekresi mukus sebagai mekanisme untuk perlindungan dinding tubuh
siput. Semakin tinggi jumlah mukus yang diproduksi, semakin iritan bahan untuk tubuh siput. Warna dari mukus yang diproduksi juga dapat mengindikasikan
tingkat iritasi. Normalnya mukus yang diproduksi oleh siput tidak berwarna tetapi kontak dengan bahan iritan menyebabkan sekresi mukus yang berwarna sedikit
kuning. Siput kemudian dipindahkan ke cawan petri baru, kemudian ditambahkan
1 mL Phosphat Buffer Saline PBS di dekat bagian bawah tubuh siput dan
43
didiamkan selama 60 menit. Setelah 60 menit kontak dengan bahan uji, siput akan melepaskan ALP, LDH, dan albumin. Menurut McComb, Bowers, and Posen
1979, secara umum alkaline phosphatase ALP terdapat pada 3 daerah pada tubuh moluska yaitu saluran pencernaan, organ excretory, dan pada bagian
mantel. Aktivitas ALP akan meningkat jika terjadi kerusakan sel maupun infeksi pada snails dan slugs. Lactate dehydrogenase LDH merupakan enzim sitolik
dan akan dilepaskan pertama kali saat terjadi kerusakan jaringan. Setelah 60 menit, cairan Phosphat Buffer Saline PBS yang telah kontak
dengan tubuh siput ditampung dalam tabung microtube. PBS digunakan sebagai pelarut dari biomarker kerusakan jaringan yang dilepaskan oleh siput.
Hasil slug irritation test yang didapatkan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel IX.
Tabel IX. Data slug irritation test
Bahan Uji Pengukuran
Persen mukus LDH
UL ALP
UL Albumin
μgmL
CMC-Na 4 Non Iritan
1 -12,426
-3,360 1,100
36,697 2
-12,197 0,000
2,200 0,000
3 -70,925
6,720 4,400
12,232 4
-20,290 0,000
2,200 489,297
5 -14,817
-3,360 4,400
67,797 6
-17,714 -3,360
2,200 257,627
7 -15,626
0,000 3,300
122,699 8
-16,109 6,720
5,500 -24,540
9 -13,578
10,080 5,500
-53,691 10
-11,296 0,000
3,300 40,268
Propilen glikol 8 Non iritan
1 -11,427
-6,720 0,000
48,930 2
-16,657 -3,360
5,500 48,930
3 -19,594
-20,160 5,500
48,930 4
-19,414 0,000
6,600 134,557
5 -8,134
3,360 3,300
67,797 6
-11,804 -6,720
5,500 216,949
7 -4,835
3,360 5,500
171,779 8
-13,511 0,000
5,500 -24,540
9 -8,852
-3,360 15,400
26,846 10
-8,621 3,360
8,800 53,691
44
Tabel IX lanjutan
Bahan Uji Pengukuran
Persen mukus LDH
UL ALP
UL Albumin
μgmL
Gliserin 100 Iritan
1 51,412
-6,720 9,900
97,859 2
51,497 0,000
39,600 12,232
3 50,606
3,360 24,200
12,232 4
42,041 -10,080
53,900 146,789
5 37,937
-3,360 45,100
122,034 6
38,145 -3,360
85,800 230,508
7 44,106
3,360 36,300
196,319 8
40,437 -3,360
50,600 24,540
9 41,166
3,360 23,100
80,537 10
43,009 3,360
35,200 93,960
Salisilat 0,5 Non iritan
1 2,778
-6,720 2,200
48,930 2
15,296 -3,360
2,200 61,162
3 12,021
-3,360 3,300
61,162 4
5,358 -3,360
13,200 85,627
5 7,148
23,520 5,500
67,797 6
6,844 -3,360
4,400 244,068
7 12,450
0,000 5,500
171,779 8
6,819 3,360
6,600 36,810
9 7,141
13,440 6,600
26,846 10
13,863 -6,720
7,700 67,114
SLS 1 Iritan
1 27,180
-3,360 8,800
36,697 2
25,319 0,000
13,200 48,930
3 5,956
-3,360 16,500
61,162 4
-8,224 -3,360
19,800 146,789
5 18,357
-23,520 12,100
122,034 6
14,098 0,000
17,600 244,068
7 9,646
0,000 11,000
245,399 8
17,775 3,360
11,000 85,890
9 22,586
6,720 15,400
40,268 10
16,606 -6,710
23,100 40,268
Laktat 0,5 Non iritan
1 9,534
3,360 3,300
48,930 2
4,479 -6,720
3,300 0,000
3 1,970
-3,360 4,400
110,092 4
-3,959 3,360
4,400 -122,324
5 6,331
0,000 4,400
40,678 6
7,727 0,000
4,400 284,746
7 1,777
0,000 4,400
-12,270 8
-1,620 3,360
4,400 12,270
9 2,719
-3,360 3,300
26,846 10
10,541 0,000
0,000 53,691
Arbutin 5 Non Iritan
1 -10,704
-6,720 6,600
-146,789 2
11,755 0,000
2,200 48,930
3 0,210
3,360 3,300
110,092 4
1,515 3,360
3,300 73,394
5 9,924
0,000 3,300
135,593 6
9,753 -6,720
5,500 284,746
7 7,509
-3,360 3,300
-12,270 8
2,686 0,000
6,600 12,270
9 8,246
13,440 4,400
-26,846 10
0,064 10,080
12,100 67,114
Keterangan: Persen mukus adalah perbandingan jumlah total mukus yang dihasilkan oleh siput setelah 60 menit pemaparan bahan uji dengan bobot siput; Nilai ALP Alkaline phosphatase adalah selisih aktivitas
enzim ALP tiap menit; Nilai LDH Lactate dehydrogenase adalah selisih aktivitas enzim LDH tiap menit; Nilai albumin adalah nilai konsentrasi albumin dalam sampel.
45
Penentuan nilai ALP, LDH, dan albumin menggunakan sampel PBS yang direaksikan dengan reagen yang terdapat pada masing-masing kit ALP, LDH, dan
albumin, pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. ALP bertindak sebagai katalis pada hidrolisis p-nitrofenilfosfat menjadi p-nitrofenol
dan fosfat, p-nitofenol mempunyai absorbansi pada panjang gelombang 405 nm. Jumlah p-nitrofenol yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi katalitik dari
ALP yang ada pada sampel. Semakin tinggi kadar ALP pada sampel maka semakin banyak p-nitrofenol yang terbentuk.
p -nitrofenilfosfat + H
2
O fosfat + p-nitrofenol 1
LDH merupakan suatu enzim yang mengandung 5 isoenzim yang berbeda yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi l-laktat. Jumlah laktat
yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi katalitik dari LDH yang ada pada sampel. Prinsip pengukurannya semakin banyak jumlah LDH dalam sampel maka
semakin tinggi laktat yang terbentuk. Piruvat + NADH + H
+
Laktat + NAD
+
2 Albumin akan membentuk kompleks warna dengan bromkresol hijau
BCG, intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kandungan albumin dalam sampel. Semakin tinggi kandungan albumin pada sampel albumin maka
intensitas warna hijau yang ditimbulkan akan semakin tinggi. BCG + albumin
kompleks BCG-Albumin 3
E. Validasi Slug Irritation Test Menggunakan CART
