23
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental menggunakan rancangan penelitian faktorial.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi karbopol 940
sebagai gelling agent dan gliserin sebagai humektan. b.
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat fisik, stabilitas fisik dan aktivitas antibakteri gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau.
c. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kecepatan
putaran mixer, kondisi penyimpanan gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau, kepadatan suspensi bakteri Escherichia coli, lama inkubasi serta
jumlah bahan lain yang digunakan dalam formulasi. d.
Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah suhu, kelembaban ruangan dan kemungkinan penguapan minyak daun sirih
hijau.
2. Definisi operasional
a. Gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau adalah sediaan semisolid
berupa gel yang menggunakan gelling agent yaitu karbopol 940 dan humektan yaitu gliserin, serta bahan lain yang diformulasikan dengan
penambahan minyak daun sirih hijau yang berfungsi sebagai antibakteri.
b. Minyak daun sirih hijau Piper betle Linn adalah minyak esensial
dari daun sirih hijau Piper betle Linn yang diperoleh dari CV. Nusa Aroma Tangerang.
c. Gelling agent adalah pembentuk sediaan gel yang akan membentuk
matriks tiga dimensi yang berpengaruh terhadap bentuk sediaan gel. Gelling agent yang digunakan pada penelitian ini adalah karbopol
940. d.
Humektan adalah komponen dari sediaan gel yang berfungsi sebagai pelembab, dalam penelitian ini menggunakan gliserin.
e. Sifat fisik dan stabilitas fisik gel hand sanitizer minyak daun sirih
hijau adalah parameter yang dapat menunjukkan kualitas fisik dari sediaan gel hand sanitizer yang dibuat. Sifat fisik sediaan pada
penelitian ini ditunjukkan oleh hasil pengamatan organoleptis, pH, viskositas, dan daya sebar. Stabilitas fisik ditunjukkan berdasarkan
pengamatan viskositas dan daya sebar pada penyimpanan selama 30 hari pada suhu ruangan.
f. Viskositas adalah besarnya tahanan yang ada pada gel hand sanitizer
minyak daun sirih hijau dengan satuan dpa.s. Hal ini berkaitan dengan kemampuan gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau untuk dituang
dan keluar dari wadah. Kriteria penerimaan respon viskositas yaitu pada range viskositas 30-90 d.Pa.s.
g. Daya sebar adalah diameter penyebaran gel hand sanitizer minyak
daun sirih hijau pada alat uji horizontal double plate selama 1 menit dengan beban 125 g yang dinyatakan dalam satuan cm. Kriteria
penerimaan respon daya sebar yaitu pada range 12,560 – 38,465 cm
2
. h.
Area optimum adalah area dari komposisi karbopol 940 dan gliserin yang mampu memberikan viskositas 30-90 dPa.s dan daya sebar 4-7
cm. i.
Aktivitas antibakteri gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau adalah kemampuan dari gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau dalam
menghambat bakteri Escherichia coli yang ditunjukkan oleh diameter zona hambat yang dihasilkan.
j. Zona hambat adalah zona jernih di mana tidak ada pertumbuhan
bakteri Escherichia coli di sekitar paper disk
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah minyak daun sirih hijau CV. Nusa Aroma, Tangerang, bakteri uji Escherichia coli Balai
Laboratorium Kesehatan, Yogyakarta, media Mueller Hinton Agar Oxoid, Mueller Hinton Broth Oxoid, karbopol 940 kualitas farmasetis, gliserin
kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas farmasetis, natrium metabisulfit kualitas farmasetis, akuades pH 7.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan analitik OHAUS®, glasswares Pyrex, cawan porselen, mixer Miyako, kertas
indikator pH Merck,Germany, paper disk ukuran 6 mm, horizontal double plate, viscometer seri VT 04 Rion, Japan, stopwatch, penggaris, vortex, autoklaf
MODEL KT-40, ALP Co. Ltd Midorigouka, Japan, dan inkubator.
E. Tata Cara Penelitian
1. Karakterisasi minyak daun sirih hijau
a. Pengamatan organoleptis. Dilakukan pengamatan organoleptis terhadap
minyak daun sirih hijau yang digunakan dalam penelitian, meliputi: bentuk, warna, dan bau.
b. Verifikasi indeks bias minyak daun sirih hijau. Indeks bias minyak daun
sirih diukur menggunakan hand refractometer. Penutup prisma dibuka kemudian diteteskan sebanyak 1 atau 2 tetes minyak daun sirih hijau pada
prisma utama. Penutup prisma ditutup perlahan sampai menyentuh prisma utama. Skala 1, 2, atau 3 diatur dengan memutar knob hingga tanda
tergantung dari konsentasi sampel yang diuji. Jarak jangkauan adalah skala 1 untuk indeks bias 1,333
– 1,404 skala sebelah kiri, skala 2 untuk indeks bias 1,404
– 1,468 skala tengah, dan skala 3 untuk indeks bias 1,468 – 1,520 skala sebelah kanan. Ujung hand refractometer diarahkan kearah
cahaya yang terang, dilihat melalui lensa sambil diputar-putar hingga skala terlihat jelas. Tampak garis batas yang memisahkan sisi yang terang dan
gelap pada bagian atas dan bawah. Jika garis batas berwarna atau tidak jelas, maka ring diputar untuk menghilangkan warna hingga batas terlihat jelas.
c. Verifikasi bobot jenis minyak daun sirih hijau. Piknometer yang digunakan
dicuci menggunakan air setelah itu dicuci lagi menggunakan etanol lalu dikeringkan dan ditimbang untuk mendapatkan bobot piknometer kosong.
Piknometer diisi air hingga penuh lalu ditutup kemudian piknometer tersebut dimasukkan ke dalam baskom berisi es dan suhu diturunkan
menjadi 23°C setelah itu dikeluarkan dari baskom dan suhu dikembalikan menjadi 25°C lalu piknometer tersebut dilap hingga kering dan ditimbang,
didapatkan bobot piknometer ditambah bobot air. Kemudian volume air dihitung dengan cara bobot air dibagi dengan kerapatan air. Bobot jenis
minyak daun sirih hijau diukur dengan menggunakan piknometer yang telah dikalibrasi, dengan menetapkan bobot piknometer kosong dan bobot air
pada suhu 25°C. Piknometer diisi minyak daun sirih hijau hingga penuh lalu ditutup kemudian piknometer tersebut dimasukkan ke dalam baskom berisi
es dan suhu dikembalikan manjadi suhu 25°C lalu piknometer tersebut dilap hingga kering dan ditimbang, didapatkan bobot piknometer ditambah bobot
minyak daun sirih hijau. Bobot piknometer yang telah diisi minyak daun sirih kemudian dikurangi bobot piknometer kosong untuk memperoleh
bobot minyak daun sirih. Kerapatan minyak daun sirih dihitung dengan cara bobot minyak daun sirih dibagi dengan volume air. Bobot jenis minyak
daun sirih merupakan perbandingan anatara bobot jenis minyak daun sirih
dengan kerapatan air, pada suhu 25°C. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali.
2. Uji aktivitas antibakteri minyak daun sirih hjau
a. Pembuatan stok bakteri Escherichia coli
Media Mueller Hinton Agar MHA dimasukan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf
pada suhu 121°C selama 15 menit. Selanjutnya dimiringkan dan dibiarkan memadat. Diambil 1 ose biakan murni Escherichia coli dan diinokulasikan
secara goresan zig-zag, kemudian diinkubasi selama 48 jam papada suhu 37°C dalam inkubator.
b. Pembuatan suspensi Escherichia coli
Satu ose koloni bakteri Escherichia coli diambil dari stok bakteri, dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi media Mueller Hinton
Broth MHB steril, kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C dalam inkubator, selanjutnya kekeruhan suspensi bakteri Escherichia coli
disesuaikan dengan standar 0,5 Mac Farland 1,5 x 10
8
CFU mL. c.
Pembuatan kontrol media Media MHA steril dituang ke dalam cawan petri, dan ditunggu
hingga memadat, kemudian diinkubasikan selama 48 jam dengan suhu 37°C. setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan.
d. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Escherichia coli
Dalam kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri, kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50°C,
cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam, dengan suhu 37°C.
setelah inkubasi, diamati pertumbuhan bakteri uji melalui kekeruhan media dan dibandingkan dengan perlakuan.
e. Uji aktivitas antibakteri minyak daun sirih hijau terhadap Escherichia coli.
Dalam kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri, kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50°C,
cawan petri digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Media dibiarkan memadat. Kemudian paper disk yang telah mengandung minyak
daun sirih hijau diletakkaan diatas media steril. Sebanyak 6 paper disk pada 1 media steril dengan setiap paper disk mengandung larutan minyak daun
sirih hijau dengan konsentrasi 1, 2, 3, 4, 5 dan kontrol negatif etanol 95 kemudian, sebanyak 5 paper disk pada 1 cawan media dengan setiap
paper disk mengandung larutan minyak daun sirih dengan konsentrasi 6, 7, 8, 9, 10. Selanjutnya, diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. setelah
diinkubasi, diameter zona hambat yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong dan dicatat. Replikasi dilakukan sebanyak tiga
kali.
3. Formula gel hand sanitizer
Formula yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada formula Sari
dan Isadiartuti 2006, seperti yang tersaji dalam tabel II.
Tabel II. Formula gel hand sanitizer
Bahan Komposisi bv
Ekstrak daun sirih 25
Karbopol 940 0,5
TEA 0,5
Gliserin 1
Corigen odoris melon 8 tetes
Natrium metabisulfit 0,2
Aquadest 200mL
Sari dan Isadiartuti, 2006 Dilakukan modifikasi terhadap formula di atas sehingga dihasilkan
formula baru seperti pada tabel III.
Tabel III. Formula gel hand sanitizer hasil modifikasi
Bahan F1
Fa Fb
Fab
Minyak daun sirih hijau g
10 10
10 10
Karbopol 940 g 1
3 1
3 Gliserin g
2 2
10 10
TEA g 3,7
3,7 3,7
3,7 Natrium metabisulfit
g 0,4
0,4 0,4
0,4 Aquadest ml
187,9 187,9
187,9 187,9
4. Pembuatan gel hand sanitizer
Karbopol 940 dikembangkan dengan aquadest dengan cara menaburkan karbopol 940 di atas aquadest campuran 1. Pengembangan dilakukan selama
24 jam. Gliserin dan natrium metabisulfit yang sebelumnya sudah dilarutkan dengan aquadest ditambahkan ke dalam campuran 1 dan dilakukan pengadukan
dengan mixer dengan skala kecepatan 1 selama 1 menit, lalu TEA ditambahkan
hingga terbentuk gel dengan pengadukan menggunakan mixer dengan skala 1 selama 1 menit. Kemudian ditambahkan minyak daun sirih hijau dan diukur pH
gel dengan pH 6-7 menggunakan indikator pH universal.
5. Pengujian sifat fisik gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau
a. Uji organoleptis dan pH
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati konsistensi, bau, dan warna gel 48 jam setelah pembuatan. Pengukuran pH dilakukan dengan
bantuan indikator pH universal pH strips dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan dan membandingkan warna dengan standar.
b. Uji viskositas
Pengukuran viskositas gel dilakukan setelah 48 jam pembuatan dengan menggunakan alat Viscometer Rion seri VT 04 dengan cara gel
dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang pada portable viscometer. Viskositas gel diketahui dengan mengamati jarum penunjuk viskositas.
Zatz dan Kushla, 1996. c.
Uji daya sebar Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan setelah 48 jam
pembuatan. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara gel ditimbang 0,5 gram kemudian gel diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala. Di
atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat 125 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya Garg dkk, 2002.
6. Pengujian stabilitas fisik gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau
a. Uji organoleptis dan pH
Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati konsistensi, bau, dan warna gel pada hari ke 2, 9, 16, 23. Dan 30. Pengukuran pH dilakukan
dengan bantuan indikator pH universal pH strips dengan cara memasukkannya ke dalam sediaan dan membandingkan warna dengan
standar. b.
Pengukuran viskositas Pengukuran dilakukan pada hari ke 2, 9, 16, 23, dan 30
menggunakan alat Viscometer Rion seri VT 04 dengan cara gel dimasukkan ke dalam wadah dan dipasang pada portable viscometer. Viskositas gel
diketahui dengan mengamati jarum penunjuk viskositas. Zatz dan Kushla, 1996.
c. Uji daya sebar
Pengukuran daya sebar sediaan gel dilakukan pada hari ke 2, 9, 16, 23, dan 30. Pengukuran daya sebar dilakukan dengan cara gel ditimbang 0,5
gram kemudian gel diletakkan di tengah lempeng kaca bulat berskala. Di atas gel diletakkan kaca bulat lain dan pemberat 125 gram, didiamkan
selama 1 menit, kemudian dicatat diameter sebarnya Garg dkk, 2002.
7. Pengujiaan aktivitas antibakteri gel hand sanitizer minyak daun sirih
hijau
Dalam kondisi aseptis, suspensi bakteri dituangkan pada cawan petri, kemudian ditambahkan media MHA steril dengan suhu 45-50°C, cawan petri
digoyang sehingga pertumbuhan bakteri dapat merata. Media dibiarkan memadat kemudian paper disk mengandung gel hand sanitizer minyak daun
sirih hijau diletakkan diatas media steril. Sebanyak lima paper disk pada satu cawan media steril dengan tiap paper disk mengandung formula 1, A, B, dan
AB, dan kontrol negatif yaitu basis gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37°C.
Dan diukur diameter zona hambat. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali. Uji aktivitas antibakteri sediaan gel hand sanitizer juga dibandingkan dengan
kontrol positif yang merupakan minyak daun sirih hijau konsentrasi 5 yang sudah diuji sebelumnya.
F. Analisis Hasil
Data yang diperoleh dalam penelitian ini berupa data sifat fisik, stabilitas fisik, dan aktivitas antibakteri gel hand sanitizer minyak daun sirih hijau. Analisis
statistik data menggunakan Design Expert 9.0.4 Trial dan software RStudio versi 3.1.2. untuk mengetahui signifikansi perbedaan dari data yang diperoleh.
Untuk mengetahui peningkatan konsentrasi minyak daun sirih hijau dalam menghambat bakteri Escherichia coli, dilakukan analisis statistik
parametrik ANOVA one way dengan tingkat kepercayaan 95 dan dilanjutkan uji post hoc menggunakan TukeyHSD untuk mengetahui signifikansi perbedaan daya
hambat dari 10 konsentrasi minyak daun sirih hijau. Dari hasil ANOVA, apabila diperoleh probability value p-value 0,05 maka dapat disimpulkan bahwa
terdapat perbedaan signifikan dalam kelompok data.
Data sifat fisik yaitu viskositas dan daya sebar dianalisis menggunakan Design Expert 9.0.4 Trial sehingga didapatkan interaksi dari kedua faktor pada
dua level untuk masing-masing respon. Analisis statistik yang digunakan Design Expert 9.0.4 Trial.
Mengetahui pengaruh perbedaan konsentrasi karbopol 940 dan gliserin terhadap stabilitas sediaan, digunakan uji t berpasangan. Bila nilai p-value 0,05
maka data dua kelompok yang dibandingkan berbeda signifikan. Analisis t tidak berpasangan digunakan untuk mengetahui aktivitas antibakteri sediaan gel hand
sanitizer minyak daun sirih hijau dengan nilai p-value 0,05 yang berarti data dua kelompok yang dibandingkan berbeda signifikan.
35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Karakterisasi Minyak Daun Sirih Hijau
Tujuan karakterisasi minyak daun sirih hijau adalah untuk memastikan kebenaran identitas dari minyak daun sirih hijau yang akan digunakan sebagai
bahan penelitian berdasarkan pengamatan organoleptis, penetapan bobot jenis dan indeks bias. Minyak daun sirih hijau diperoleh dari CV. Nusa Aroma disertai
dengan Certificate of Analysis CoA Lampiran 1. Hasil karakterisasi minyak daun sirih hijau di jabarkan dalam tabel IV.
Tabel IV. Hasil karakterisasi minyak daun sirih hijau
Pengujian Hasil karakterisasi
Certificate of Analysis
Pengamatan organoleptis
Berbentuk cair Berwarna kuning
kecoklatan Aroma khas
minyak daun sirih hijau Berbentuk cair
Berwarna kuning kecoklatan
Aroma khas minyak daun sirih
hijau Bobot jenis
0,970 ± 0,00 1,044
– 1,054 Indeks bias
1,514 ± 0,0005 1,514
Hasil penelitian menunjukkan organoleptis dan indeks bias minyak daun sirih hijau telah sesuai dengan CoA, sedangkan bobot jenis minyak tidak masuk
ke dalam rentang bobot jenis CoA. Hal tersebut kemungkinan disebabkan karena minyak daun sirih hijau sudah tidak stabil akibat pengaruh dari suhu, kelembaban,
dan cahaya matahari dalam proses penyimpanan dan distribusi. Minyak daun sirih
Kategori