ditambahkan hifa kering tanpa bakteri kitinolitik. Inkubasi pada
shaker water bath
150 rpm selama 24 jam. Sampel dihitung gula reduksinya yaitu kadar GlcNAc dengan metode Jeaniaux 1966 dalam Irawati 2008. Metode pengukuran kadar
GlcNAc pada uji antagonisme ini disajikan pada Lampiran 4.
3.8. Uji Awal Produksi Glukanase oleh Isolat Bakteri Kitinolitik
Isolat
Candida albicans
isolat laboratorium mikrobiologi FMIPA USU dengan konsentrasi 10
8
disebar pada media
Muller Hinton Agar
MHA dengan menggunakan
cotton swab.
Sebanyak 10µl setara dengan 10
8
bakteri kitinolitik yang telah diinokulasikan pada kertas cakram diletakkan pada keempat sisi cawan
Petri yang telah diinokulasikan
C. albicans.
Biakan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam. Pengamatan yang dilakukan adalah mengukur zona hambat yang
terbentuk yaitu zona bening di sekitar koloni bakteri.
3.9. Uji Patogenitas
Saprolegnia
sp.
Isolat
Saprolegnia
sp. diuji patogenitasnya terhadap sel telur gurami untuk mengetahui patogenitasnya terhadap sel telur. Isolat
Saprolegnia
yang digunakan adalah pada tahap zoospora sehingga perlu untuk melakukan preparasi
Saprolegnia
sp. Alur kerja preparasi
Saprolegni
a sp. tersaji pada Lampiran 5. Telur gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada wadah kaca percobaan yang memiliki volume
400 ml air steril. Aplikasi perlakuan dengan pemberian isolat zoospora
Saprolegnia
sp. sebanyak 0,4 ml 10
4
selml ke dalam wadah kaca selama masa perkembangan telur hingga menjadi larva. Kontrol tidak diberikan isolat zoospora
Saprolegnia
sp. Pengamatan yang dilakukan adalah menghitung tingkat penetasan, tingkat kematian
dan tingkat infeksi. Alur kerja uji patogenitas tersaji pada Lampiran 6.
3.10. Uji Patogenitas dan Perlekatan Mikroba pada Telur
Uji patogenitas dilakukan untuk mengetahui potensi bakteri kitinolitik sebagai patogen bagi telur. Isolat bakteri yang diguunakan dilakukan preparasi sebelum
diaplikasikan. Alur preparasi isolat bakteri kitinolitik tersaji pada Lampiran 7. Telur
Universitas Sumatera Utara
gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada wadah kaca percobaan yang memiliki volume 400 ml air steril. Aplikasi perlakuan dengan memberikan isolat
bakteri kitinolitik sebanyak 0,4 ml 10
5
selml ke dalam wadah kaca selama masa perkembangan telur hingga menjadi larva. Kontrol tidak diberikan bakteri.
Pengamatan yang dilakukan adalah menghitung tingkat penetasan dan tingkat kematian
mortality rate
. Uji kemampuan bakteri berikatan dengan jaringan sel telur dilakukan dengan
memberikan isolat bakteri kitinolitik pada telur gurami. Telur gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada tempat kaca yang memiliki volume 400 ml air steril.
Kontrol tidak diberikan bakteri kitinolitik. Perlakuan yaitu dengan memberikan isolat bakteri kitinolitik sebesar 0,4 ml 10
5
selml ke dalam wadah kaca. Pengambilan sel telur dilakukan setelah 48 jam. Sel telur yang diambil dibilas dengan menggunakan
akuadest steril tiga kali kemudian digerus dan dikultur dalam media MGMC. Bakteri
yang tumbuh diamati pembentukan zona bening apakah merupakan bakteri kitinolitik yang ditambahkan. Telur yang telah diinokulasikan bakteri selama 48 jam dan tahap
larva diambil dan difiksasi menggunakan
formaline buffer saline
untuk uji histologi setelah untuk mengetahui perubahan struktur sel dan respons sel terhadap bakteri.
Alur kerja uji patogenitas dan perlekatan tersaji pada Lampiran 8.
3.11. Tahap Evaluasi Efek Bakteri Kitinolitik Secara
in Vivo
Pada tahap ini dilakukan evaluasi pengaruh bakteri kitinolitik terhadap infeksi
Saprolegnia
sp. pada telur. Parameter yang akan diamati adalah jumlah telur yang terinfeksi
infection rate
, tingkat penetasan
hatching rate
dan tingkat kematian
mortality rate
telur gurami. Telur gurami umur 3 hari berasal dari pembenihan tradisional di Yogyakarta.
Telur gurami merupakan hasil fertilisasi alami induk betina dewasa dan jantan dewasa. Hanya telur yang sehat yang akan ditetaskan. Telur akan menetas sempurna
menjadi larva rata-rata pada hari ke 10 hingga 11. Infeksi telur dapat dilakukan dengan menggunakan zoospora
Saprolegnia
sp. Koloni
Saprolegnia
umur 2 hari dipotong dengan menggunakan
Cork borer
No.2
Universitas Sumatera Utara
dengan diameter 5,5 mm dan ditempatkan di cawan petri yang terdapat 20 ml
Glucose yeast extract agar
GY agar kemudian diinkubasi 25°C selama 24 -28 jam. Miselium yang dipotong dibilas dengan akuadest steril selama 3 kali kemudian
dipindahkan ke dalam 20 ml akuades steril dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 24 jam untuk produksi zoospora. Zoospora diamati di bawah mikroskop kemudian
jumlah zoospore dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Jumlah zoospora yang diinfeksi yaitu 1 x 10
4
zoospora Hanjavanit
et al.
2008. Isolat bakteri kitinolitik ditumbuhkan pada media MGMC pada suhu ruang
selama 24 jam. Kemudian sebanyak 0,4 ml kultur bakteri kitinolitik yang setara dengan 10
5
selml ditambahkan kedalam 400 ml air di wadah kaca Lategan
et al
2004a. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui konsentrasi bakteri ini pada air di wadah percobaan dan kemampuan bakteri ini dapat hidup setelah 24 jam
dengan metode di atas. Gambar wadah kaca percobaan disajikan pada Gambar 5
.
Gambar 5. Wadah kaca untuk percobaan
3.11.1. Rancangan Percobaan
Tempat penetasan yaitu menggunakan bak kaca dengan volume 400 ml dengan pemberian aerator dan air steril Hanjavanit
et al
2008. Air disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Sebanyak 25 telur dipergunakan untuk setiap tempat
penetasan. Kelompok kontrol negatif yaitu telur yang tidak diberikan bakteri kitinolitik dan tidak diinfeksi
Saprolegnia
dan kontrol positif yaitu telur diinfeksi
Universitas Sumatera Utara
zoospora
Saprolegnia
sp. Kelompok perlakuan yaitu terdiri atas pemberian kandidat bakteri kitinolitik dengan dosis pemberian bakteri yaitu 10
5
selml dan setelah 24 jam dilakukan uji tantang dengan pemberian isolat zoospora
Saprolegnia
sp. Setiap perlakuan dilakukan ulangan 3 kali. Tingkat kematian dan tingkat penetasan telur
ikan diamati setelah diberikan zoospora. Alur kerja uji tantang secara in vivo dan cakupan kegiatan penelitian disajikan pada Lampiran 9 dan Lampiran 10.
Persentase infeksi, tingkat penetasan dan tingkat kematian telur dihitung menggunakan rumus Hanjavanit
et al
2008:
3.12. Analisis data
Hasil persentase tingkat mortalitas, daya tetas dan tingkat infeksi pada telur gurami pada kelompok perlakuan dan kontrol dianalisis dengan ANOVA kemudian
uji lanjut Tukey dengan SPSS 16.0.
Universitas Sumatera Utara
BAB 1V HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Kitinolitik
Bakteri kitinolitik pada kolam air tawar pembesaran gurami di Perbaungan Sumatera Utara telah diisolasi pada penelitian ini. Sebanyak 24 isolat bakteri
menunjukkan kemampuan kitinolitik yaitu dengan membentuk zona bening pada daerah sekitar koloni. Penelitian sebelumnya telah melaporkan keberadaan bakteri
kitinolitik di danau air tawar. Bakteri kitinolitik telah diisolasi pada dua danau yang berbeda yaitu danau
eutrophic
dan
mesotrophic
Brzezinska Donderski 2006. Donderski Brzezinska 2001 melaporkan bahwa beberapa bakteri kitinolitik telah
diisolasi dari danau air tawar dan genus
Aeromonas
sp. mendominasi bakteri kitinolitik tersebut. Isolat bakteri kitinolitik pada media kitin disajikan pada Lampiran
11. Isolat bakteri kitinolitik memiliki kemampuan dalam menghidrolisis kitin
pada media sehingga daerah yang berada di sekitar koloni isolat bakteri menjadi zona bening. Enzim yang menghidrolisis kitin adalah enzim kitinase yang dihasilkan oleh
bakteri apabila ada yang menginduksinya. Glukosamin yang merupakan residu dari kitin yang telah deasitilasi dapat menginduksi kitinase Sahai Monacha 1993.
Kitin yang dipreparasi dari hidrolisis parsial HCl 10 N menghasilkan koloidal kitin mampu menginduksi kitinase kompleks seperti N-asetilglukosamidase, endokhitinase
dan khitobiosidase pada
Aeromonas caviae
Inbar Chet 1991. Media MGMC yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas koloidal kitin yang dapat menginduksi
kitinase isolat bakteri untuk menghidrolisis kitin pada media. Pengamatan morfologi dan uji biokimia sederhana dilakukan pada 10 isolat
bakteri potensial. Uji yang dilakukan meliputi uji motilitas, uji gelatin, uji sitrat, uji katalase, uji TSIA dan uji pati. Bentuk morfologi bervariasi yaitu bentuk koloni bulat
Universitas Sumatera Utara