Uji Patogenitas dan Perlekatan Mikroba pada Telur Analisis data

ditambahkan hifa kering tanpa bakteri kitinolitik. Inkubasi pada shaker water bath 150 rpm selama 24 jam. Sampel dihitung gula reduksinya yaitu kadar GlcNAc dengan metode Jeaniaux 1966 dalam Irawati 2008. Metode pengukuran kadar GlcNAc pada uji antagonisme ini disajikan pada Lampiran 4.

3.8. Uji Awal Produksi Glukanase oleh Isolat Bakteri Kitinolitik

Isolat Candida albicans isolat laboratorium mikrobiologi FMIPA USU dengan konsentrasi 10 8 disebar pada media Muller Hinton Agar MHA dengan menggunakan cotton swab. Sebanyak 10µl setara dengan 10 8 bakteri kitinolitik yang telah diinokulasikan pada kertas cakram diletakkan pada keempat sisi cawan Petri yang telah diinokulasikan C. albicans. Biakan diinkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam. Pengamatan yang dilakukan adalah mengukur zona hambat yang terbentuk yaitu zona bening di sekitar koloni bakteri.

3.9. Uji Patogenitas

Saprolegnia sp. Isolat Saprolegnia sp. diuji patogenitasnya terhadap sel telur gurami untuk mengetahui patogenitasnya terhadap sel telur. Isolat Saprolegnia yang digunakan adalah pada tahap zoospora sehingga perlu untuk melakukan preparasi Saprolegnia sp. Alur kerja preparasi Saprolegni a sp. tersaji pada Lampiran 5. Telur gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada wadah kaca percobaan yang memiliki volume 400 ml air steril. Aplikasi perlakuan dengan pemberian isolat zoospora Saprolegnia sp. sebanyak 0,4 ml 10 4 selml ke dalam wadah kaca selama masa perkembangan telur hingga menjadi larva. Kontrol tidak diberikan isolat zoospora Saprolegnia sp. Pengamatan yang dilakukan adalah menghitung tingkat penetasan, tingkat kematian dan tingkat infeksi. Alur kerja uji patogenitas tersaji pada Lampiran 6.

3.10. Uji Patogenitas dan Perlekatan Mikroba pada Telur

Uji patogenitas dilakukan untuk mengetahui potensi bakteri kitinolitik sebagai patogen bagi telur. Isolat bakteri yang diguunakan dilakukan preparasi sebelum diaplikasikan. Alur preparasi isolat bakteri kitinolitik tersaji pada Lampiran 7. Telur Universitas Sumatera Utara gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada wadah kaca percobaan yang memiliki volume 400 ml air steril. Aplikasi perlakuan dengan memberikan isolat bakteri kitinolitik sebanyak 0,4 ml 10 5 selml ke dalam wadah kaca selama masa perkembangan telur hingga menjadi larva. Kontrol tidak diberikan bakteri. Pengamatan yang dilakukan adalah menghitung tingkat penetasan dan tingkat kematian mortality rate . Uji kemampuan bakteri berikatan dengan jaringan sel telur dilakukan dengan memberikan isolat bakteri kitinolitik pada telur gurami. Telur gurami sehat sebanyak 25 buah ditempatkan pada tempat kaca yang memiliki volume 400 ml air steril. Kontrol tidak diberikan bakteri kitinolitik. Perlakuan yaitu dengan memberikan isolat bakteri kitinolitik sebesar 0,4 ml 10 5 selml ke dalam wadah kaca. Pengambilan sel telur dilakukan setelah 48 jam. Sel telur yang diambil dibilas dengan menggunakan akuadest steril tiga kali kemudian digerus dan dikultur dalam media MGMC. Bakteri yang tumbuh diamati pembentukan zona bening apakah merupakan bakteri kitinolitik yang ditambahkan. Telur yang telah diinokulasikan bakteri selama 48 jam dan tahap larva diambil dan difiksasi menggunakan formaline buffer saline untuk uji histologi setelah untuk mengetahui perubahan struktur sel dan respons sel terhadap bakteri. Alur kerja uji patogenitas dan perlekatan tersaji pada Lampiran 8.

3.11. Tahap Evaluasi Efek Bakteri Kitinolitik Secara

in Vivo Pada tahap ini dilakukan evaluasi pengaruh bakteri kitinolitik terhadap infeksi Saprolegnia sp. pada telur. Parameter yang akan diamati adalah jumlah telur yang terinfeksi infection rate , tingkat penetasan hatching rate dan tingkat kematian mortality rate telur gurami. Telur gurami umur 3 hari berasal dari pembenihan tradisional di Yogyakarta. Telur gurami merupakan hasil fertilisasi alami induk betina dewasa dan jantan dewasa. Hanya telur yang sehat yang akan ditetaskan. Telur akan menetas sempurna menjadi larva rata-rata pada hari ke 10 hingga 11. Infeksi telur dapat dilakukan dengan menggunakan zoospora Saprolegnia sp. Koloni Saprolegnia umur 2 hari dipotong dengan menggunakan Cork borer No.2 Universitas Sumatera Utara dengan diameter 5,5 mm dan ditempatkan di cawan petri yang terdapat 20 ml Glucose yeast extract agar GY agar kemudian diinkubasi 25°C selama 24 -28 jam. Miselium yang dipotong dibilas dengan akuadest steril selama 3 kali kemudian dipindahkan ke dalam 20 ml akuades steril dan diinkubasi pada suhu 25°C selama 24 jam untuk produksi zoospora. Zoospora diamati di bawah mikroskop kemudian jumlah zoospore dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Jumlah zoospora yang diinfeksi yaitu 1 x 10 4 zoospora Hanjavanit et al. 2008. Isolat bakteri kitinolitik ditumbuhkan pada media MGMC pada suhu ruang selama 24 jam. Kemudian sebanyak 0,4 ml kultur bakteri kitinolitik yang setara dengan 10 5 selml ditambahkan kedalam 400 ml air di wadah kaca Lategan et al 2004a. Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui konsentrasi bakteri ini pada air di wadah percobaan dan kemampuan bakteri ini dapat hidup setelah 24 jam dengan metode di atas. Gambar wadah kaca percobaan disajikan pada Gambar 5 . Gambar 5. Wadah kaca untuk percobaan

3.11.1. Rancangan Percobaan

Tempat penetasan yaitu menggunakan bak kaca dengan volume 400 ml dengan pemberian aerator dan air steril Hanjavanit et al 2008. Air disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Sebanyak 25 telur dipergunakan untuk setiap tempat penetasan. Kelompok kontrol negatif yaitu telur yang tidak diberikan bakteri kitinolitik dan tidak diinfeksi Saprolegnia dan kontrol positif yaitu telur diinfeksi Universitas Sumatera Utara zoospora Saprolegnia sp. Kelompok perlakuan yaitu terdiri atas pemberian kandidat bakteri kitinolitik dengan dosis pemberian bakteri yaitu 10 5 selml dan setelah 24 jam dilakukan uji tantang dengan pemberian isolat zoospora Saprolegnia sp. Setiap perlakuan dilakukan ulangan 3 kali. Tingkat kematian dan tingkat penetasan telur ikan diamati setelah diberikan zoospora. Alur kerja uji tantang secara in vivo dan cakupan kegiatan penelitian disajikan pada Lampiran 9 dan Lampiran 10. Persentase infeksi, tingkat penetasan dan tingkat kematian telur dihitung menggunakan rumus Hanjavanit et al 2008:

3.12. Analisis data

Hasil persentase tingkat mortalitas, daya tetas dan tingkat infeksi pada telur gurami pada kelompok perlakuan dan kontrol dianalisis dengan ANOVA kemudian uji lanjut Tukey dengan SPSS 16.0. Universitas Sumatera Utara

BAB 1V HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Kitinolitik

Bakteri kitinolitik pada kolam air tawar pembesaran gurami di Perbaungan Sumatera Utara telah diisolasi pada penelitian ini. Sebanyak 24 isolat bakteri menunjukkan kemampuan kitinolitik yaitu dengan membentuk zona bening pada daerah sekitar koloni. Penelitian sebelumnya telah melaporkan keberadaan bakteri kitinolitik di danau air tawar. Bakteri kitinolitik telah diisolasi pada dua danau yang berbeda yaitu danau eutrophic dan mesotrophic Brzezinska Donderski 2006. Donderski Brzezinska 2001 melaporkan bahwa beberapa bakteri kitinolitik telah diisolasi dari danau air tawar dan genus Aeromonas sp. mendominasi bakteri kitinolitik tersebut. Isolat bakteri kitinolitik pada media kitin disajikan pada Lampiran 11. Isolat bakteri kitinolitik memiliki kemampuan dalam menghidrolisis kitin pada media sehingga daerah yang berada di sekitar koloni isolat bakteri menjadi zona bening. Enzim yang menghidrolisis kitin adalah enzim kitinase yang dihasilkan oleh bakteri apabila ada yang menginduksinya. Glukosamin yang merupakan residu dari kitin yang telah deasitilasi dapat menginduksi kitinase Sahai Monacha 1993. Kitin yang dipreparasi dari hidrolisis parsial HCl 10 N menghasilkan koloidal kitin mampu menginduksi kitinase kompleks seperti N-asetilglukosamidase, endokhitinase dan khitobiosidase pada Aeromonas caviae Inbar Chet 1991. Media MGMC yang digunakan pada penelitian ini terdiri atas koloidal kitin yang dapat menginduksi kitinase isolat bakteri untuk menghidrolisis kitin pada media. Pengamatan morfologi dan uji biokimia sederhana dilakukan pada 10 isolat bakteri potensial. Uji yang dilakukan meliputi uji motilitas, uji gelatin, uji sitrat, uji katalase, uji TSIA dan uji pati. Bentuk morfologi bervariasi yaitu bentuk koloni bulat Universitas Sumatera Utara