Perubahan histologi
menunjukkan bahwa
infeksi
Saprolegnia
sp. menyebabkan peradangan dan degenerasi vakuolar pada bagian lapisan luar telur
yang terdapat hifa
Saprolegnia
. Perubahan pada lapisan telur ini disebabkan
Saprolegnia
mengeluarkan enzim untuk mendegradasi komponen lapisan pada telur. Pada telur umur 7 hari maka lapisan dermal dan epidermal telur menunjukkan
perubahan peradangan dan degenerasi vakuolar. Perubahan yang sama dilaporkan oleh Giesker
et al.
2006 yaitu infeksi
Saprolegnia
pada ikan salmon
Onchorhyncus mykiss
ditemukan hemorrhagi dan peradangan mononuklear pada bagian tepi lesi, degenerasi vakuolar pada sel epitel dan degenerasi pada jaringan pengikat dan otot.
Gejala klinis dan perubahan jaringan telur gurami serta tahapan telur menjadi larva menunjukkan bahwa isolat
Saprolegnia
sp. mampu menyebabkan infeksi sehingga bersifat patogen bagi telur.
Telur terinfeksi diambil sampelnya dan diisolasi pada media GYA kemudian dilakukan pengamatan morfologi. Hasil uji reisolasi pada telur yang terinfeksi
menunjukkan bahwa telur tersebut yang terinfeksi oleh isolat yang sama dengan isolat
Saprolegnia
sp. yang diinfeksikan. Hal ini menunjukkan telur yang terinfeksi pada penelitian ini disebabkan karena isolat
Saprolegnia
sp.
4.5. Hasil Patogenitas dan Perlekatan Bakteri Kitinolitik
Uji patogenitas dilakukan untuk mengetahui apakah isolat bakteri tersebut bersifat patogen terhadap telur gurami. Uji patogenitas merupakan salah satu tahapan
penting dalam menentukan mikroba yang bisa digunakan sebagai probiotik. Mikroba yang digunakan sebagai kontrol biologi dalam akuakultur harus memiliki beberapa
persyaratan satu diantaranya adalah mikroba tersebut harus tidak menyebabkan penyakit atau patogen terhadap inang
Verschuere
et al.
2000. Isolat bakteri potensial berdasarkan uji in vitro yang diuji lebih lanjut adalah
sebanyak 10 bakteri yaitu PB3A, PB01, PB02, PB05, PB08, PB10, PB13, PB14, PB15, dan PB17. Hasil uji menunjukkan bahwa isolat bakteri PB01 menunjukkan
tingkat mortalitas paling tinggi yaitu 28 dan daya tetas paling rendah yaitu 72, sedangkan isolat bakteri yang lain tingkat mortalitas berada dibawah 20.
Universitas Sumatera Utara
Patogenitas bakteri PB01 terhadap telur dan larva yang sudah menetas dipelajari pada penelitian ini dengan pengamatan jaringan pada telur hari ke empat
dan larva ikan. Gambaran histologi telur ikan normal yaitu telur terdiri dari dua lapisan yaitu lapisan terluar berwarna merah terang dan lapisan bagian dalam
berwarna merah muda Hanjavanit
et al.
2008. Pada telur ikan gurami yang dinokulasi isolat bakteri PB01 terdapat proliferasi sel radang dan kongesti pada
lapisan luar telur. Hal ini menunjukkan adanya peradangan pada mukosa telur. Gambaran histologi larva ikan yang diinkulasikan PB01 menunjukkan perubahan
proliferasi sel radang pada kulit, edema dan proliferasi sel radang pada otot, disertai degenerasi hidropis pada hati dan ginjal. Perubahan patologi telur dan larva disajikan
pada Gambar 13.
Gambar 13. Gambaran histologi telur dan larva ikan. A Telur kontrol menunjukkan histologi normal B Telur yang diinokulasikan
bakteri PB01 menunjukkan akumulasi darah kongesti pada lapisan luar telur B1. C Kulit dan otot larva ikan kontrol. D
Larva ikan diinokulasikan bakteri PB01 menunjukkan peradangan disertai edema pada otot dan epithelial lifting pada kulit D1:D2
A B
C D
B1
D1 D2
Universitas Sumatera Utara
Kulit dapat merefleksikan sesuatu hal yang terjadi pada tubuh ikan baik perubahan yang bersifat patologis maupun fisiologis. Beberapa penyakit yang
disebabkan oleh agen infeksius dapat menyebabkan perubahan pada kulit. Perubahan yang dapat terjadi pada kulit yang disebabkan oleh bakteri
Aeromonas
sp. adalah peradangan disertai nekrosis sel pada kulit dan otot Ferguson 1989. Perubahan yang
ditemukan pada uji patogenitas bakteri potensial adalah peradangan disertai edema pada kulit dan otot. Pada kontrol tidak ditemukan perubahan di atas. Pada telur ikan
ditemukan juga akumulasi sel darah pada lapisan luar telur. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri yang diinokulasikan pada ikan telah melakukan infeksi pada larva
ikan. Bakteri PB01 bersifat patogen terhadap telur dan larva ikan. Hal tersebut menyebabkan bakteri ini tidak dapat digunakan sebagai pengendali hayati infeksi
Saprolegnia
sp. pada telur gurami. Isolat bakteri potensial diharapkan tidak memberikan pengaruh terhadap
organ tubuh larva setelah menetas seperti cacat atau perubahan abnormalitas lainnya. Abnormalitas larva dibedakan menjadi 6 kategori yaitu ekor tidak ada, bentuk tubuh
seperti siput, tulang belakang bengkok,
siamese twin,
abnormalitas kuning telur dan bentuk lainnya yang diluar dari 5 bentuk abnormalitas sebelumnya Espeland
Hansen 2004. Berdasarkan pengamatan mikroskopis maka bentuk abnormalitas yang dijumpai adalah bengkok tulang belakang pada satu isolat bakteri yaitu isolat kode
PB3A dan perubahan tersebut tidak berbeda nyata dengan kontrol P0,05. Hal ini menunjukkan bahwa isolat bakteri potensial tersebut tidak menyebabkan
abnormalitas pada larva yang menetas dari telur yang diberi perlakuan bakteri tersebut. Hasil pengamatan mikroskopis larva disajikan pada lampiran 13.
Isolat bakteri memiliki kemampuan sebagai probiotik apabila dapat melekat pada permukaan mukosa sel. Probiotik memiliki mekanisme yaitu berkompetisi
dengan patogen pada permukaan mukosa sel inang sehingga mencegah kolonisasi patogen pada permukaan sel
Verschuere
et al
2000. Penelitian ini melakukan isolasi bakteri kitinolitik terhadap telur gurami setelah 48 jam inokulasi untuk mengetahui
keberadaan bakteri pada permukaan telur. Hasil isolasi disajikan pada Tabel 7.
Universitas Sumatera Utara
Tabel 7. Hasil isolasi ulang bakteri pada telur gurami pada media MGMC
Kode Bakteri Koloni Bakteri dengan Zona Bening
PB3A +
PB01 +
PB02 +
PB05 +
PB08 +
PB10 +
PB13 +
PB14 +
PB15 +
PB17 ±
Kontrol -
Keterangan : + = Ada koloni bakteri dengan zona bening ± = Ada koloni bakteri dengan zona bening kecil
- = Tidak ada koloni bakteri dengan zona bening Tabel 7 menunjukkan bahwa semua isolat bakteri memiliki kemampuan
melekat pada permukaan telur ikan terkecuali kode PB17 yang menunjukkan hasil sedikit perlekatan. Mekanisme perlekatan bakteri pada mukosa di permukaan usus
merupakan salah satu syarat bahwa bakteri tersebut bisa dijadikan sebagai probiotik. Kemampuan perlekatan ataupun tumbuh pada mukosa di usus maupun mukosa
permukaan luar tubuh ikan secara in vitro telah banyak dilaporkan. Balcazar
et al.
2007 melaporkan bahwa beberapa strain
Lactic Acid Bacteria
LAB memiliki kemampuan perlekatan dan memproduksi bahan antagonis untuk menghambat
pertumbuhan patogen
Flavobacterium psychrophillum
dengan pengujian secara in vitro, sehingga LAB tersebut dapat dijadikan kandidat probiotik.
Kemampuan bakteri patogen mengkolonisasi mukosa tubuh merupakan salah satu mekanisme patogenisitasnya. Garcia
et al.
1997 melaporkan bahwa
Vibrio anguilarum
sebagai patogen menunjukkan kemampuan perlekatan pada usus ikan salmon dan peningkatan mukosa. Bakteri kandidat pengendali hayati yang memiliki
kemampuan melekat pada mukosa akan mengurangi patogenisitas bakteri patogen dengan mekanisme kompetisi sehinga keberadaan bakteri pengendali hayati akan
Universitas Sumatera Utara
menghambat perlekatan patogen pada mukosa Watson
et al.
2006. Mekanisme ini digunakan untuk aplikasi probiotik pada tahap awal perkembangan ikan sebelum
terpapar dengan bakteri pada masa budidaya. Penelitian ini melakukan pengamatan terhadap permukaan sel telur dengan
Scanning Electron Microscope
SEM. Hasil SEM menunjukkan bahwa permukaan pada mukosa telur perlakuan yang diberi isolat bakteri menunjukkan peningkatan
mukus atau lendir yang ditandai dengan bentukan seperti lipatan – lipatan yang tebal
Gambar 14A dibandingkan dengan permukaan sel telur kontrol Gambar 14B. Gambaran permukaan pada mukosa telur kontrol dan telur perlakuan yang diberi
isolat bakteri kitinolitik dengan SEM disajikan pada Gambar 14.
Gambar 14. Gambaran permukaan sel Telur Gurami dengan
Scanning Electron
Microscope
. Permukaan sel telur ikan kontrol A Permukaan sel telur ikan
perlakuan dengan
pemberian isolat
bakteri potensial
menunjukkan bentukan seperti lipatan-lipatan yang merupakan mukus yang tebal sehingga bakteri yang terselimutinya tidak terlihat dengan
perbesaran ini SEM x 5000.
Hasil SEM tidak menunjukkan adanya bakteri yang melekat disebabkan karena tertutup oleh mukus. Pada kontrol tidak ditemukan bakteri maupun mukus
sehingga keberadaan mukus disebabkan karena respon terhadap bakteri yang dinokulasikan pada telur perlakuan. Hal ini sejalan dengan laporan Martinez
et al.
2004 yang menyebutkan bahwa dengan permukaan penuh dengan mukus menyebabkan bakteri
Flavobacterium psychrifillum
pada sirip ikan dengan SEM
A B
Universitas Sumatera Utara
tidak terllihat. Metoda pemotongan preparat melewati mukosa kemudian di SEM kembali dengan perbesaran tinggi maka terdapat bagian yang tidak tertutup mukus
dapat ditemukan banyak bakteri tersebut Martinez
et al.
2004. Perbesaran 5000 x pada penelitian ini belum bisa mendeteksi keberadaan bakteri yang tertutup oleh
mukus telur ikan. Pada penelitian yang dilaporkan Decostere
et al.
1999 memperlihatkan bahwa bakteri pada permukaan filamen dan lamina insang tampak
hanya seperti bentukan tikar dengan perbesaran 5000x dan dengan perbesaran lebih tinggi yaitu 8000x maka bakteri
F. columnare
terlihat bahwa gambaran seperti tikar adalah kumpulan bakteri panjang halus yang terselimuti oleh mukus.
Isolat bakteri yang melekat pada telur menyebabkan sekresi mukus oleh telur sebagai respon adanya keberadaan bakteri tersebut.
Bakteri pengendali hayati dengan kemampuan perlekatannya juga memberikan pengaruh negatif terhadap patogen
dengan merangsang mukosa untuk menghasilkan biofilm dan mukus atau lendir pada kulit. Olsson
et al.
1992 melaporkan bahwa isolat bakteri kandidat probiotik yang diambil dari usus ikan
Turbot Scophthalmus maximus
memiliki kemampuan melekat, menghasilkan biofilm, sekresi mukus lendir pada kulit dan serum albumin
lebih banyak dibandingkan
V. anguillarum
. Kemampuan tersebut mengindikasikan bahwa isolat bakteri tersebut dapat berkompetisi untuk menghambat pertumbuhan
patogen
V. anguillarum
Olsson
et al.
1992. Uji perlekatan yang telah dilakukan pada beberapa isolat bakteri di atas
menunjukkan bahwa bakteri tersebut dapat melekat dan meningkatkan mukus pada permukaan mukosa. Mukus mengandung imunoglobulin, lizozim, komplement dan
tripsin like protease yang dapat mendegradasi bakteri gram negatif sehingga merupakan mekanisme pertahanan yang dapat mengeliminasi patogen Braun
et al.
1990. Isolat bakteri potensial PB3A, PB02, PB05, PB08, PB10, PB13, PB14, PB15,
dan PB17 berdasarkan uji patogenitas dan perlekatan kemungkinan dapat dijadikan
sebagai pengendali hayati.
Universitas Sumatera Utara
4.6. Hasil Uji Antagonisme secara In Vivo
