30
c. Pembuatan kolom gel Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke
dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan aquabides untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku
dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu diangkat sisirnya. Kemudian
dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis. d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu
dielektroforesis selama + 100 menit pada 200 Volt, 40 mA. e. Pewarnaan gel
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining gel warna biru Coomassie R-250, selama + 1 jam.
f. Pencucian gel Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250, selama + 1 hari.
Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan LabImage 1D.
3.3.10. Analisis Hidrolisis FDA
Dimasukkan 1 ml supernatan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 ml KH
2
PO
4
buffer pH 7,8 60 nM. Reaksi dimulai dengan menambahkan 40 µg FDA kemudian divorteks dan diinkubasi selama 20 menit.
Setelah penginkubasian segera ditambahkan aseton sebanyak 5 ml untuk menghentikan reaksi lalu ditutup dengan aluminium foil. Suspensi disaring
dengan kertas Whatmann No. 1. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
31
ditutup dengan parafilm dan disimpan dalam es batu untuk menguapkan aseton. Nilai absorbansi ditera dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 490 nm Breeuwer, 1996.
3.3.11. Pengukuran Absorbansi Produk Biosolubilisasi Batubara
Supernatan dari biosolubilisasi batubara disentrifugasi 5400 rpm selama 30 menit kemudian diukur nilai absorbansinya dengan menggunakan
Spektrofotometer UV-Vis Ionic Genesys 2 pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat solubilisasi batubara Silva, 2007. Nilai
absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula, data tersebut digunakan sebagai dasar untuk menyeleksi isolat kapang.
3.3.12. Analisis Hasil Solubilisasi Batubara oleh Kapang Indigenous dengan
Menggunakan GC-MS
Supernatan dari biosolubilisasi batubara dan pelarut dicampurkan dengan perbandingan 1:1, pelarut yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter
dengan perbandingan 3:1:1. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam corong Buchner lalu diaduk sampai bercampur kemudian didiamkan beberapa saat
sampai terbentuk fase atas dan bawah, fase atas dipakai untuk mengidentifikasi jenis senyawa dan menentukan kadar hasil solubilisasi batubara dengan
menggunakan GC-MS Silva, 2007. Karakteristik produk biosolubilisasi dilakukan menggunakan alat GCMS
merk Shimadzu dengan tipe QP2010S Gambar 11, suhu injektor 280
o
C, injektor mode split, waktu pengambilan sampel 1 menit, suhu kolom 40 – 270
o
C dengan pengaturan suhu awal 40
o
C ditahan selama 5 menit, dan waktu 10 menit untuk mencapai suhu 270
o
C 23
o
Cmenit ditahan selama 60 menit, sehingga total
32
waktu program 88 menit, suhu detektor 280
o
C, suhu interval 250
o
C, gas pembawa He, tekanan utama 500-900, Flow control mode pressure, tekanan 10,9
Kpa, total flow 58,8 mlm, aliran kolom 0,55 mlm, percepatan linier 26,0 cmdt, aliran pembersihan 3.0 mlm, split ratio 99,8, jenis kolom Rtx-5MS, panjang
kolom 30.00 m, ketebalan 0.25 µm, diameter 0,25 mm, dan jenis pengion EI Electron Impact 70 eV Whetstine et al., 2003.
3.3.13. Analisa Data
