18
senyawa fenolik kompleks yang memiliki berat molekul 500-3000. Tanin berfungsi sebagai pengganti batubara, karena dalam batubara juga mengandung
senyawa fenol. Difusi warna cokelat muncul karena adanya proses oksidasi dari tanin oleh enzim fenol oksidase Gambar 7.
2.5. Metode untuk Penentuan Protein Ekstraseluler
Protein yang berasal dari kata proteos utama atau pertama merupakan senyawa makromolekul yang memiliki peranan penting pada setiap makhluk
hidup. Protein dihasilkan dari proses ekspresi genetik molekul DNA yang terdapat di dalam sel. Protein adalah suatu polipeptida dengan bobot molekul yang sangat
bervariasi, dari 5000 hingga lebih dari satu juta. Disamping berat molekul yang berbeda-beda, protein mempunyai sifat yang berbeda-beda pula, dengan fungsi
yang spesifik ditentukan oleh gen yang sesuai Poedjiadi dan Titin, 1994. Pada penelitian ini, untuk menentukan kadar protein ekstraseluler
digunakan metode Lowry. Metode Lowry dikembangkan pada tahun 1951 dengan menggunakan reagen pendeteksi Folin-Ciocalteu. Reaksi antara Cu
2+
dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin
dan triptofan merupakan suatu protein akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reaksi fosfomolibdat dan fosfotungstat. Oleh
karena itu warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode Lowry mempunyai keuntungan karena 100 kali lebih sensitif dari
metode biuret. Hasil reduksi ini dapat dianalisa lebih lanjut dengan melihat puncak absorpsi yang lebar pada daerah panjang gelombang sinar tampak 600-
800 nm Apriyanto et al., 1989. Dalam kadar analisa protein dengan cara Lowry, diperlukan protein standar sebagai pembanding misalnya BSA Bouvine Serum
19
Albumin yang memiliki rentang konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada di dalam rentang tersebut.
2.6. Elektroforesis Protein
Menurut Yuwono 2005, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik
yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Kecepatan gerak molekul tergantung pada nisbah rasio muatan
terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Elektroforesis dapat digunakan untuk keperluan preparatif, selain bersifat
analitik, bentuknya ada yang bersifat kolom, ada pula yang lempengan. Salah satu jenis elektroforesis adalah elektroforesis SDS-PAGE Gambar 8. Sodium
Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS-PAGE terutama dilakukan untuk menetapkan berat molekul protein. SDS-PAGE adalah suatu
teknik biologi molekular yang digunakan untuk memisahkan protein sesuai dengan ukuran. Pada tahun 1998, Laborda et al., menganalisis enzim-enzim
pengsolubilisasi batubara dengan menggunakan metode SDS PAGE. Enzim esterase, lakase, mangan peroksidase serta enzim lignin peroksidase terbukti ada
atau terdeteksi setelah dilakukan karakterisasi dengan SDS PAGE.
Gambar 8. Seperangkat alat elektroforesis 1 D
20
Pada mekanisme SDS PAGE, protein bereaksi dengan SDS yang merupakan deterjen anionik membentuk kompleks yang bermuatan negatif.
Protein akan terdenaturasi dan terlarut membentuk kompleks berikatan dengan SDS, berbentuk elips atau batang, dan berukuran sebanding dengan berat molekul
protein. Protein dalam bentuk kompleks yang bermuatan negatif ini terpisahkan berdasarkan muatan dan ukurannya secara elektroforesis di dalam matriks gel
poliakrilamid. Berat molekul protein dapat diukur dengan menggunakan protein standar yang telah diketahui berat molekulnya Garfin, 2003. Gambar 9
menunjukkan gambar denaturasi protein oleh SDS.
Gambar 9. Denaturasi protein oleh SDS Experimental Biosciences,
2007. Elektroforesis gel SDS dilakukan pada pH mendekati netral. Adanya SDS
menyebabkan protein rantai ganda akan terdisosiasi menjadi rantai-rantai individual yang terdenaturasi oleh detergent ini, sehingga susunan yang tadinya
teratur struktur 3 dimensi menjadi rusak membentuk konfigurasi “Random Coil”. Peristiwa ini dibantu oleh adanya merkaptoetanol yang memecah ikatan-
ikatan disulfida antar ataupun dalam rantai mereduksi ikatan disulfida menjadi gugus-gugus sulfihidril Hames, 1998. Oleh karena itu protein dapat dipisahkan
hanya berdasarkan ukurannya BM, di mana kompleks SDS protein yang lebih
21
besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil Garfin, 2003.
2.7. Spektrofotometer UV-Vis
