28
3.3.6. Kultur Inokulum Spora
Isolat kapang diremajakan menggunakan medium PDA pada cawan petri dan diinkubasi pada suhu ruang sampai menghasilkan spora. Sebanyak ± 10 ml
NaCl 0,85 dimasukkan kedalam cawan petri inokulum spora kemudian miselia kapang dipecahkan menggunakan ose steril lalu dimasukkan ke dalam yellow tube
kemudian divortex sampai kapang larut dalam NaCl.
3.3.7. Biosolubilisasi Batubara
Kultur inokulum spora sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung erlenmeyer yang berisi 200 ml medium MSS+ dengan jumlah spora yang
diinginkan 10
8
selml, lalu dihomogenkan. Kemudian dilakukan enam perlakuan, dimana perlakuan I, II, III digunakan sebagai kontrrol tanpa batubara.
Tabel 2. Jenis Perlakuan yang digunakan
Perlakuan MSS+ ml
Kultur Inokulum Spora 1 ml
Batubara I
200 ml B1
- II
200 ml B2
- III
200 ml B3
- IV
200 ml B1
5 V
200 ml B2
5 VI
200 ml B3
5
Tahap selanjutnya, yaitu diinkubasi dengan menggunakan shaking incubator dengan kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 28 hari.
Pencuplikan sampel kultur dilakukan pada hari ke 0, 7, 14, 21, dan 28 untuk dilakukan pengamatan kolonisasi, pH medium, dan solubilisasi terhdap batubara.
3.3.8. Pengukuran Kadar Protein Ekstraselular
Sebanyak 0,5 ml sampel ditambahkan 2,5 ml larutan Lowry I dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,25 ml
29
larutan Lowry II, divortek dan diinkubasi pada suhu ruang selam 30 menit. Setelah itu absorbansi dibaca dengan Spektrofotometer UVVis pada panjang
gelombang 750 nm dan dibandingkan dengan standar Bouvine Serum Albumin BSA.
3.3.9. Analisis Profil Protein dengan Elektroforesis SDS-PAGE
Pada penelitian ini menggunakan metode elektroforesis 1 dimensi SDS- PAGE dengan sistem buffer Laemmli. Konsentrasi gel poliakrilamida yang
digunakan adalah 10. a. Preparasi sampel
Kultur inokulum spora pada hari ke-21 untuk kapang B1 dan hari ke-7 untuk kapang B2 dan B3 diambil sebanyak 75
µl dengan mikropipet ke dalam tabung effendorf, lalu ditambahkan buffer sampel sebanyak 25
µl dan divortek hingga homogen, kemudian dipanaskankan selama + 5 menit, setelah itu
disentrifugasi selama 5 menit. b. Preparasi gel elektroforesis
- Separating gel 10 30 Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer 1,5 M
Tris-HCl, pH 6,8 sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabides 7,5 ml, SDS 50 µl dan 10 Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml.
- Stacking gel 45 30 Acrylamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer 0,5 M
Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabides 3,6 ml, SDS 25 µl dan 10 Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml.
30
c. Pembuatan kolom gel Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke
dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan aquabides untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku
dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu diangkat sisirnya. Kemudian
dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis. d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu
dielektroforesis selama + 100 menit pada 200 Volt, 40 mA. e. Pewarnaan gel
Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining gel warna biru Coomassie R-250, selama + 1 jam.
f. Pencucian gel Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250, selama + 1 hari.
Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan LabImage 1D.
3.3.10. Analisis Hidrolisis FDA
Kategori