26
3.3. Prosedur Kerja
3.3.1. Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat-alat yang digunakan
dibersihkan, lalu disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol
70. 3.3.2.
Persiapan Serbuk Batubara
Batubara dihaluskan menggunakan mortar secara aseptik di dalam Laminar Air Flow Cabinet LAFC, kemudian disaring menggunakan saringan
berukuran 0,2 mm 200 mesh. Serbuk batubara yang telah siap disimpan di dalam cawan petri steril untuk digunakan sebagai sumber isolasi kapang indigenous
batubara lignit Sumatera Selatan dan campuran untuk pembuatan medium isolasi dan seleksi kapang hasil isolasi tersebut Silva et al., 2007.
3.3.3. Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar PDA
Sebanyak 7,8 g PDA bubuk dilarutkan dalam aquades 200 ml pada erlenmeyer. Kemudian dipanaskan dengan menggunakan hot plate dan magnetic
stirer hingga larut. Medium PDA tersebut dimasukkan kedalam autoklaf 2 atm dengan suhu 121
o
C selama 15 menit setelah itu didinginkan dan dituang pada cawan petri.
3.3.4. Pembuatan Medium Minimal Salt Solution+ MSS+
Pembuatan medium MSS+ dibuat dengan menyiapkan medium MSS sebanyak 250 ml kemudian ditambahkan sukrosa 2,5 g lalu dihomogenkan.
Medium MSS+ dalam erlenmeyer dan tabung reaksi disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. Medium
27
Minimal Salt MMS dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0,52 g MgSO
4
.7H
2
O ; 0,003 Zn SO
4
.7H
2
O pH 5,5; 5 g K
2
HPO
4
; 0,005 g FeSO
4
dan 1 g NH
4
SO
4
, lalu ditambahkan 1 liter aquades kemudian dilarutkan sampai homogen
Silva et al, 2007. 3.3.5.
Uji Kualitatif Enzim Ekstraselular 3.3.5.1. Fenol Oksidase
Reaksi-warna Bavendamm secara luas digunakan untuk mengidentifikasi kapang. Kapang dikultur pada cawan petri yang mengandung tanin, terlihat difusi
cokelat pada permukaan media kultur. Adanya difusi berwarna cokelat mengindikasikan adanya fenol oksidase. Tanin 4 mM L ditambahkan pada
medium PDA dan pada diameter pertumbuhan miselium dan lingkaran cokelat tercatat setiap hari Tao et al., 2009.
3.3.5.2. Lignin Peroksidase
Metode memudar digunakan untuk mengidentifikasi adanya peroksidase. Metilen biru 0,1 g L ditambahkan ke dalam medium kultur PDA yang
ditumbuhi dengan kapang. Warna yang memudar dari medium menunjukkan keberadaan enzim lignin peroksidase Tao et al., 2009.
3.3.5.3. Mangan peroksidase MnP
MnCl
2
· 4H
2
O 0,1g L telah ditambahkan ke dalam medium kultur PDA dan kapang kemudian diinokulasi selama dua minggu. Selama waktu kultur
dilihat perkembangan bintik hitam cokelat. MnP mengkatalisis oksidasi MnCl
2
menjadi MnO
2
sehingga menghasilkan spot berwarna coklat hitam Tao et al., 2009.
28
3.3.6. Kultur Inokulum Spora
Kategori