Alat-Alat Bahan-Bahan Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Jengkol EEBJ

BAB III METODE PENELITIAN

Metode penelitian ini dilakukan dengan metode eksperimental yang meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi sampel, pembuatan simplisia, pembuatan pereaksi, pemeriksaan karakteristik simplisia, skrining fitokimia. Penyiapan hewan percobaan, pengujian efek ekstrak etanol biji jengkol terhadap penurunan kadar glukosa darah tikus putih jantan dengan metode induksi aloksan menggunakan rancangan acak lengkap RAL. Data hasil penelitian dianalisis dengan metode analisis variansi ANAVA dengan tingkat kepercayaan 95, dilanjutkan dengan metode uji Duncan untuk melihat perbedaan nyata antar perlakuan menggunakan program SPSS Statistical Product and Service Solution versi 17. Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 20 halaman 85.

3.1 Alat-Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi lemari pengering, blender Philip, oven Memmert, neraca listrik Mettler Toledo, neraca hewan GW-1500, mikroskop, desikator, penangas air, freeze dryer Virtis , rotary evaporator Heidolph WB 2000, Glucometer GlucoDr TM dan Glucotest strip GlucoDr TM strip test , magnetic stirer, spuit, oral sonde, mortir dan stamfer, alat- alat gelas dan alat laboratorium lainnya.

3.2 Bahan-Bahan

Universitas Sumatera Utara Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah biji jengkol Pithecellobium lobatum Benth. Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa kecuali dinyatakan lain adalah kloral hidrat, toluen, kalium iodida, bismuth nitrat, asam nitrat, iodium, α-naftol, besi III klorida, timbal II asetat, serbuk seng, serbuk magnesium, asam asetat anhidrida, isopropanol, natrium hidroksida, asam klorida pekat, asam sulfat pekat, kloroform, n-heksan, metanol, etanol 96 teknis, larutan fisiologis NaCl 0,9, aloksan Sigma Aldrich, Na- CMC Natrium-Carboxy Methyl Cellulose, metformin, dan air suling teknis. 3.3 Prosedur Pembuatan Simplisia 3.3.1 Pengumpulan Bahan Tumbuhan Sampel yang digunakan adalah biji jengkol Pithecellobium lobatum yang masih segar dan tua. Pengambilan sampel dilakukan secara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Sampel diambil dari pasar tradisional di Pasar Pancur Batu, jalan Jamin Ginting, Kabupaten Deli Serdang , Provinsi Sumatera Utara.

3.3.2 Identifikasi Tumbuhan

Identifikasi tumbuhan dilakukan Steffi 2010 di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara, Medan. Hasil identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1 halaman 56.

3.3.3 Pembuatan Simplisia

Bahan baku biji jengkol tua yang masih segar dikumpulkan, dibuang bagian yang tidak diperlukan sortasi basah, dicuci bersih di bawah air mengalir, Universitas Sumatera Utara ditiriskan, dan ditimbang berat basahnya. Biji jengkol selanjutnya dirajang dengan ukuran ± 2 mm dan dikeringkan di lemari pengering hingga kering, dibuang benda-benda asing atau pengotoran-pengotoran lain yang masih tertinggal pada simplisia kering sortasi kering, kemudian ditimbang berat keringnya dan diblender hingga agak halus dan disimpan dalam wadah plastik yang tertutup rapat.

3.4 Pembuatan Pereaksi

Pembuatan larutan pereaksi bouchardat, dragendorff, mayer, besi III klorida 4,5 bv, molish, timbal II asetat 0,4 M, asam sulfat 6 N, asam klorida 2 N, liebermann-Burchard, kloralhidrat, pembuatan larutan induksi aloksan, pembuatan suspensi Na-CMC 0,5 bv, pembuatan suspensi metformin dosis 50 mgkg bb, pembuatan suspensi EEBJ dosis 200 mgkg bb, EEBJ dosis 400 mgkg bb, dan EEBJ dosis 600 mgkg bb.

3.4.1 Pereaksi Bouchardat

Sebanyak 2 g iodium dan 4 g kalium iodida dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.2 Pereaksi Dragendorff

Sebanyak 8 g bismut III nitrat dilarutkan dalam 20 ml asam nitrat pekat. Pada wadah lain sebanyak 27,2 g kalium iodida dilarutkan dalam 50 ml air suling, kemudian kedua larutan dicampurkan dan didiamkan sampai memisah sempurna. Selanjutnya diambil lapisan jernih dan diencerkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.4.3 Pereaksi Mayer

Sebanyak 1,36 g raksa II klorida dilarutkan dalam air suling 60 ml. Pada wadah lain sebanyak 5 g kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling. Kemudian dicampur dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.4 Pereaksi Besi III Klorida 4,5 bv

Sebanyak 4,50 g besi III klorida dilarutkan dalam air hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.5 Pereaksi Molish

Sebanyak 3 g α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N dan ditambahkan air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.6 Pereaksi Timbal II Asetat 0,4 M

Sebanyak 15,17 g timbal II asetat dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.7 Larutan Asam Sulfat 6 N

Sebanyak 29,42 g asam sulfat pekat dilarutkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes, 1995.

3.4.8 Larutan Asam Klorida 2 N

Sebanyak 7,29 g asam klorida pekat dilarutkan dengan air suling hingga 100 ml Depkes RI, 1995.

3.4.9 Pereaksi Liebermann-Burchard

Universitas Sumatera Utara Sebanyak 5 ml asam asetat anhidrat dicampurkan dengan 5 ml asam sulfat pekat, lalu ditambahkan 50 ml etanol ke dalam campuran tersebut Merck and darmstadt, 1978. Universitas Sumatera Utara

3.4.10 Larutan Kloralhidrat

Sebanyak 50 g kloralhidrat dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes, 1995.

3.4.11 Pembuatan Larutan Induksi Aloksan

Aloksan dilarutkan dalam larutan NaCl 0,9 bv dengan konsentrasi 5 bv. Perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 68.

3.4.12 Pembuatan Suspensi Na-CMC 0,5 bv

Sebanyak 0,5 g Na-CMC 0,5 bv ditaburkan dalam lumpang yang berisi ±30 ml air suling panas. Didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang transparan, lalu digerus sampai homogen, diencerkan dengan air suling dan dimasukkan ke labu tentukur 100 ml, dicukupkan volumenya dengan air suling hingga 100 ml. 3.4.13 Pembuatan Suspensi Metformin dosis 50 mgkgBB Tablet Metformin digerus dan diambil sebanyak 60 mg, dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5 bv sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen, volume dicukupkan hingga 5 ml. Perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 69. 3.4.14 Pembuatan Suspensi Ekstrak Etanol Biji Jengkol dengan 3 Variasi Dosis yakni dosis 200 mgkg BB, 400 mgkgBB, 600 mgkg BB Sejumlah 200 mg, 400 mg, dan 600 mg ekstrak etanol biji jengkol dimasukkan ke dalam lumpang dan ditambahkan suspensi Na-CMC 0,5 bv sedikit demi sedikit sambil digerus sampai homogen hingga 5 ml. Perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 71. Universitas Sumatera Utara Universitas Sumatera Utara

3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia

Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari larut dalam air, penetapan kadar sari larut dalam etanol, penetapan kadar abu total, dan penetapan kadar abu tidak larut dalam asam Depkes RI, 1995 ; WHO, 1992.

3.5.1 Pemeriksaan Makroskopik dan Organoleptik

Pemeriksaan makroskopik dan organolepik dilakukan dengan mengamati bentuk, bau, rasa, warna dan ukuran dari biji jengkol segar, dan serbuk simplisia biji jengkol. Hasil pemeriksaan makroskopik dapat dilihat pada Lampiran 2 halaman 57. 3.5.2 Pemeriksaan Mikroskopik Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap biji jengkol segar dan serbuk simplisia biji jengkol. Biji jengkol dipotong melintang dan membujur lalu diletakkan di atas kaca objek yang telah ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan kaca penutup, selanjutnya diamati di bawah mikroskop. Begitu juga halnya pemeriksaan pada serbuk simplisia. Hasil pemeriksaan mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 59.

3.5.3 Penetapan Kadar Air

Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi destilasi toluena. Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung penerima 5 ml berskala 0,05ml, alat penampung dan pemanas listrik. Cara kerja : Universitas Sumatera Utara Dimasukkan 200 ml toluena dan 2 ml air suling ke dalam labu alas bulat, lalu didestilasi selama 2 jam. Setelah itu, toluena dibiarkan mendingin selama 30 menit, dan dibaca volume air pada tabung penerima dengan ketelitian 0,05 ml. Kemudian ke dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Setelah toluena mendidih, kecepatan tetesan diatur lebih kurang 2 tetes tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan tetesan dinaikkan hingga 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluena. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluena memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992. Hasil penetapan kadar air dapat dilihat pada Lampiran 4 halaman 60.

3.5.4 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Air

Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam, lalu disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah ditara dan sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar sari larut dalam air dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 61. Universitas Sumatera Utara

3.5.5 Penetapan Kadar Sari Larut dalam Etanol

Sebanyak 5 g serbuk simplisia, dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105 o C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar sari larut dalam etanol dapat dilihat pada Lampiran 6 halaman 62.

3.5.6 Penetapan Kadar Abu Total

Sebanyak 2 atau 3 g serbuk simplisia dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, jika arang masih tidak dapat dihilangkan, ditambahkan air panas, saring melalui kertas saring bebas abu. Pijarkan sisa dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrat ke dalam krus, uapkan, pijarkan hingga bobot tetap, timbang. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar abu total dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 63.

3.5.7 Penetapan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam

Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam dikumpulkan, disaring melalui kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, dipijarkan, kemudian didinginkan dan ditimbang sampai bobot tetap. Kadar abu Universitas Sumatera Utara yang tidak larut dalam asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan Depkes, 1995. Hasil penetapan kadar abu total larut dapat dilihat pada Lampiran 7 halaman 63.

3.6 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia serbuk simplisia meliputi pemeriksaan senyawa golongan flavoinoid, alkaloid, saponin, tanin, glikosida dan steroidtriterpenoid. 3.6.1 Pemeriksaan Flavanoid Serbuk simplisia ditimbang 0,5 g, lalu ditambahkan 10 ml metanol, direfluks selama 10 menit, disaring panas-panas melalui kertas saring. Filtrat diencerkan dengan 10 ml air suling, setelah dingin ditambahkan 5 ml petroleum eter, dikocok hati-hati, lalu didiamkan sebentar. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada temperatur 40 o C, sisanya dilarutkan dalam 5 ml etilasetat, disaring. Filtratnya digunakan untuk uji flavonoid dengan cara berikut : a. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 2 ml etanol 96, lalu ditambah 0,5 g serbuk Zn dan 2 ml asam klorida 2 N. Didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat. Jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonol. b. Sebanyak 1 ml filtrat diuapkan sampai kering, sisa dilarutkan dalam 1-2 ml etanol 96, lalu ditambah 0,1 g serbuk Mg dan 10 tetes asam klorida pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai warna merah ungu menunjukkan adanya flavonoid. Jika terjadi warna kuning jingga menunjukkan adanya flavon, kalkon dan auron Depkes, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.6.2 Pemeriksaan Alkaloid

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan di atas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk tes alkaloid. Diambil 3 tabung reaksi, lalu ke dalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi : a. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer b. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat c. Ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.

3.6.3 Pemeriksaan Saponin

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 menit. Jika terbentuk busa setinggi 1-10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan buih tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Depkes,1995.

3.6.4 Pemeriksaan Tanin

Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml larutan dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru kehitaman atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin Depkes, 1995. Universitas Sumatera Utara

3.6.5 Pemeriksaan Glikosida

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari dengan 30 ml campuran etanol 96-air 7:3 dan 10 ml asam klorida 2 N, direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat, ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran kloroform-isopropanol 3:2 sebanyak 3 kali. Pada kumpulan sari lapisan isopropanol diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 o C. Sisanya dilarutkan dengan 2 ml metanol untuk larutan percobaan. 0,1 ml larutan percobaan diuapkan diatas penangas air, pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes Molish, kemudian ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat, terbentuk cincin berwarna ungu pada batas cairan, menunjukkan adanya ikatan gula Depkes, 1995. 3.6.6 Pemeriksaan Steroid Triterpenoid Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g, dimaserasi dengan 20 ml n- heksan selama 2 jam, disaring. Filtrat diuapkan dalam cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchard melalui dinding cawan. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah menjadi biru ungu atau biru hijau menunjukkan adanya triterpenoidsteroid Harborne, 1987.

3.7 Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Jengkol EEBJ

Pembuatan ekstrak etanol biji jegkol dilakukan dengan metode perkolasi. Caranya 500 gram serbuk simplisia dimaserasi dengan etanol 96 selama 3 jam. Selanjutnya dipindahkan massa tersebut sedikit demi sedikit ke dalam perkolator, Universitas Sumatera Utara tambahkan etanol 96 secukupnya hingga simplisia terendam dan terdapat cairan penyari di atasnya, perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian kran perkolator dibuka dan dibiarkan cairan ekstrak menetes dengan kecepatan 1 ml per menit dan ditambahkan etanol 96 berulang- ulang secukupnya dengan meletakkan corong pisah di atas perkolator dan diatur kecepatan penetesan cairan penyari sama dengan kecepatan tetesan perkolat,sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Perkolasi dihentikan jika 500 mg perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Perkolat kemudian disuling dan diuapkan dengan tekanan rendah pada suhu tidak lebih dari 50 C menggunakan rotary evaporator, kemudian dipekatkan dengan bantuan alat freeze dryer sehingga diperoleh ekstrak kental sebanyak 97 gram Depkes, 1986.

3.8 Penyiapan Hewan Percobaan