39 dalam corong pisah, ditambahkan 100 ml n-heksana dikocok dan didiamkan
sampai terbentuk 2 lapisan yang terpisah, lapisan n-heksana lapisan atas diambil dengan cara dialirkan dan ditampung, prosedur ini dilakukan sampai lapisan n-
heksana memberikan hasil negatif dengan pereaksi Liebermann-Burchard, semua fraksi yang diperoleh diuapkan dengan penguap vakum putar rotary evaporator
pada suhu tidak lebih dari 50
o
C. Bagan fraksinasi ekstrak etanol daun gaharu dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 61.
3.9 Analisis Fraksi n-heksana secara KLT
Kromatografi lapis tipis KLT digunakan untuk mendapatkan fase gerak yang terbaik untuk dipakai pada KLT hasil kromatografi kolom. Terhadap fraksi
n-heksana daun gaharu dilakukan analisis secara KLT menggunakan fase diam silika gel F
254
dan fase gerak campuran n-heksana-etilasetat dengan perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30 dan 60:40, dengan penampak bercak
Liebermann-Burchard. Cara kerja:
Ekstrak dilarutkan dalam n-heksana, ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukan ke dalam chamber yang telah jenuh dengan uap fase gerak.
Setelah pengembangan selesai plat dikeluarkan dan dikeringkan, plat disemprot dengan penampak bercak Liebermann-Burchard dan dipanaskan di oven pada
suhu 110 ℃ selama beberapa menit Gritter, et al., 1991. Warna yang terbentuk
diamati dan dihitung harga Rf semua bercak. Fase gerak yang menghasilkan noda bercak paling banyak jumlahnya adalah fase gerak yang terbaik. Hasil analisis
fraksi n-heksana secara KLT dapat dilihat pada Lampiran 8 halaman 72.
Universitas Sumatera Utara
40
3.10 Pemisahan Fraksi n-heksana dengan Kromatografi Kolom
Kandungan kimia yang terdapat dalam fraksi n-heksana dipisahkan secara kromatografi kolom menggunakan pelarut landaian n-heksana-etilasetat dengan
perbandingan 100:0, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70,
20:80, 10:90, 0:100 dan metanol.
Cara kerja: Seperangkat alat kromatografi kolom dipasang dan pada dasar kolom
dimasukkan kapas yang telah bebas dari lemak, kemudian dimasukkan larutan fase gerak. Silika gel 60H dibuat bubur dengan fase gerak sampai bebas
gelembung udara, kran dibuka kemudian bubur silika dimasukkan ke dalam kolom secara perlahan-lahan sambil dinding kolom diketuk-ketuk dan fase gerak
tetap dialiri sampai silika gel turun, lalu didiamkan sampai kolom kompak, selanjutnya fase gerak turun sampai setinggi lebih kurang 1 cm di atas fase diam,
lalu kran ditutup. Kemudian fraksi n-heksana yang sebelumnya telah dicampur dengan silika gel 60H dimasukkan ke dalam kromatografi kolom sambil fase
gerak ditambah sedikit demi sedikit, setelah sampel turun kran dibuka perlahan- lahan sambil fase gerak terus ditambah. Eluat yang keluar ditampung dalam vial,
masing-masing sebanyak 5 ml. Hal ini dilakukan sampai eluat memberikan hasil negatif terhadap pereaksi Liebermann-Burchard. Hasil dipantau dengan
kromatografi lapis tipis menggunakan fase gerak n-heksana-etilasetat 80:20, sebagai penampak bercak digunakan pereaksi Liebermann-Burchard. Eluat yang
mempunyai pola kromatogram yang sama digabung menjadi satu fraksi Sastrohamidjojo, 1985. Hasil kromatografi kolom dapat dilihat pada Lampiran 9
halaman 73 sampai 77.
Universitas Sumatera Utara
41
3.11 Pencucian Kristal Isolat
Terhadap vial-vial yang berisi kristal isolat hasil pemisahan fraksi n- heksana dengan kromatografi kolom dilakukan pencucian menggunakan pelarut
metanol dingin tetes demi tetes hingga didapatkan isolat berbentuk kristal jarum,
berwarna putih yang merupakan senyawa golongan steroidtriterpenoid.
3.12 Isolasi Senyawa SteroidTriterpenoid Hasil Kromatografi Kolom
dengan KLT Preparatif
Terhadap fraksi hasil kromatografi kolom yang memberikan noda bercak sama dilakukan isolasi secara KLT preparatif, sebagai fase gerak digunakan n-
heksana-etilasetat 20:80 dan fase diam silika gel F
254
, dan sebagai penampak bercak digunakan pereaksi Liebermann-Burchard.
Cara kerja: Fraksi ditotolkan berupa pita pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat KLT
berukuran 20 x 10 cm yang telah diaktifkan, setelah kering plat KLT dimasukkan ke dalam bejana yang telah jenuh dengan uap fase gerak, pengembang dibiarkan
naik membawa komponen yang ada, setelah mencapai batas pengembangan plat dikeluarkan dari bejana lalu dikeringkan. Bagian tengah plat ditutup dengan kaca
yang bersih sedangkan pada sisi kanan dan kiri plat disemprot dengan penampak bercak Liebermann-Burchard. Bagian tengah plat yang sejajar dengan bercak
berwarna hijau biru dikerok dan dikumpulkan, direndam dengan metanol satu malam lalu disaring kemudian pelarutnya diuapkan, kemudian dilakukan uji
kemurnian dengan KLT terhadap isolat yang diperoleh Hostettmann, et al., 1995. Hasil KLT Preparatif dapat dilihat pada Lampiran 11 halaman 78.
Universitas Sumatera Utara
42
3.13 Uji Kemurnian terhadap Isolat 3.13.1 Uji KLT satu arah
