24 Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat
bercak. Harga Rf berada antara 0,00 - 1,00. Harga Rf ini sangat berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa Eaton, 1989.
Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf adalah sebagai berikut Sastrohamidjojo, 1985:
a. struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan b. sifat penyerap
c. tebal dan kerataan lapisan penyerap d. jenis pelarut dan derajat kemurniannya
e. derajat kejenuhan uap pengembang dalam bejana f. teknik percobaan
g. jumlah cuplikan yang digunakan h. suhu
i. kesetimbangan
2.5.2 Kromatografi kolom
Kromatografi cair yang dilakukan didalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar
lebih dari 1 g. Kromatografi kolom berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan gelas penyaring di dalamnya. Ukuran kolom tergantung pada banyaknya
zat yang akan dipisahkan. Menahan penyerap yang diletakkan di dalam kolom dapat digunakan gelas wool atau kapas Sastrohamidjojo, 1985.
Kromatografi kolom biasanya dikembangkan dengan campuran pelarut yang terus-menerus berubah dengan cara landaian. Eluat yang keluar dari dasar
kolom harus dipantau untuk mengetahui dimana linarut itu berada. Ini dapat
Universitas Sumatera Utara
25 dilakukan secara terus-menerus dengan memakai detektor yang cocok atau
dengan membagi eluat dalam tabung reaksi atau vial-vial yang berurutan dan menganalisisnya dengan KLT Gritter, et al., 1991.
2.5.3 Kromatografi lapis tipis preparatif
Kromatografi lapis tipis KLT preparatif merupakan metode pemisahan yang menggunakan peralatan sederhana. Ketebalan penyerap yang sering dipakai
adalah 0,5 - 2 mm, ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm. Ketebalan lapisan yang terbatas dan ukuran plat sudah tentu mengurangi
jumlah bahan yang dapat dipisahkan dengan KLT preparatif. KLT preparatif dapat memisahkan bahan alam dalam jumlah gram, sebagian besar pemakaian
hanya dalam jumlah milligram. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan senyawa lipofil maupun campuran
senyawa hidrofil Hostettmann, et al., 1995. Penotolan cuplikan dilakukan dengan melarutkan cuplikan dalam sedikit
pelarut. Cuplikan ditotolkan berupa pita dengan lebar pita sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita. Penotolan dapat dilakukan dengan
pipet tetapi lebih baik dengan penotol otomatis. Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat.
Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan kertas saring yang tercelup ke dalam pengembang Hostettmann, et al., 1995.
Kebanyakan penyerap KLT preparatif mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang menyerap
sinar ultraviolet. Mendeteksi senyawa yang tidak menyerap sinar ultraviolet ada beberapa pilihan Hostettmann, et al., 1995:
Universitas Sumatera Utara
26 a. menambahkan senyawa pembanding
b. menutup plat dengan sepotong kaca lalu menyemprot salah satu sisi dengan pereaksi semprot
2.5.4 Kromatografi lapis tipis dua arah two-dimensional TLC
