31 propipet, kertas saring, hot plate, vorteks, magnetic stirer, autoclave, oven, shaker,
inkubator, kulkas, timbangan analitik, desikator, chromatografi gas, spektrofotometer.
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan
Sampel air laut diambil dengan menggunakan botol Winkler steril. Isolasi bakteri dari air laut Belawan menggunakan media Bushnell Hass Agar BHA yang mengandung
2 naftalen yang dilarutkan dalam aseton Kiyohara et al, 1982. Isolasi dilakukan dengan pengenceran 10
, 10
-1
, dan 10
-3
, masing-masing dengan 3 kali ulangan, kemudian diinkubasi pada suhu 33ºC selama 15-20 hari. Bakteri pengurai naftalen
diseleksi berdasarkan terbentuknya zona jernih atau warna disekeliling koloni. Setelah diperoleh bakteri yang tumbuh pada media Bushnell Hass Agar kemudian bakteri
dimurnikan pada media TSA Tripton Soya Agar untuk selanjutnya digunakan sebagai inokulum. Isolat bakteri yang diperoleh kemudian dikarakterisasi dengan
pengamatan morfologi koloni, sel, dan sejumlah uji biokimia Cappuccino Sherman, 1987. Kemudian dipilih koloni yang menunjukkan perbedaan dalam
pengamatan makroskopis dengan melihat morfologi koloni maupun secara mikroskopis, bentuk dan penataan sel serta pewarnaan gram Lay, 1994. Alur kerja
isolasi bakteri penghasil biosurfaktan dapat dilihat pada Lampiran A.
3.4.2 Uji Potensi Bakteri Penghasil Biosurfaktan dalam Mendegradasi Naftalen
Untuk memastikan bahwa bakteri mampu menguraikan naftalen, bakteri ditumbuhkan pada media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 naftalen. Sebanyak 2 ml
inokulum cair masing-masing isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan standar Mac Farland
≈10
8
selml Komposisi larutan Mac Farland dapat dilihat pada Lampiran I diinokulasikan ke dalam media Bushnell Hass Broth yang
mengandung 2 naftalen secara aseptis. Sebagai kontrol, media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 naftalen dibuat tanpa inokulum, kemudian diinkubasi pada
suhu 30ºC dengan digoyang di atas waterbath shaker pada kondisi gelap dengan 18
Universitas Sumatera Utara
32 kecepatan 150 rpm selama 15 hari. Pada hari ke-5, hari ke-10, dan hari ke-15
dilakukan estimasi kepadatan sel isolat bakteri dengan metode Standard Plate Count SPC. Kepadatan sel isolat bakteri masing-masing perlakuan dihitung dengan metode
SPC menggunakan colony counter. Untuk perhitungan estimasi jumlah sel dapat dihitung dengan rumus:
Estimasi Jumlah Sel = Jumlah koloni x 1 selml
Pengenceran
Alur kerja estimasi kepadatan sel isolat bakteri dengan metode SPC dapat dilihat pada lampiran E Fardiaz, 1992.
Kemampuan bakteri untuk menguraikan naftalen ditandai dengan menghilangnya kristal naftalen pada media setelah masa inkubasi. Sisa naftalen dalam
media akan dianalisis dengan chromatografi gas. Setelah 15 hari masa inkubasi, seluruh biakan dan kontrol diatur pHnya hingga 12 dengan menambahkan NaOH 0,1
N ke dalam seluruh media. Media kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring dan diambil filtratnya. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan
n-heksan sebanyak 10 ml kemudian diekstraksi selama ± 15 menit, ekstraksi diulangi sampai 3 kali setelah itu didiamkan hingga terbentuk dua lapisan. Lapisan bawah
adalah lapisan yang mengandung air sedangkan lapisan atas adalah lapisan n-heksan. Lapisan bawah dibuang dan lapisan atas diambil sebanyak 5 ml untuk dianalisis
dengan chromatografi gas. Sebanyak 1 µl diinjeksikan ke dalam chromatografi gas Hwlet Packard 6890, sehingga diperoleh luas area dari masing-masing sampel. Alur
kerja uji potensi bakteri penghasil biosurfaktan dalam mendegradasi naftalen dapat dilihat pada lampiran C.
3.4.3 Pembuatan Kurva Standar Naftalen untuk Chromatografi Gas
Untuk membuat kurva standar chromatografi gas, maka terlebih dahulu dibuat larutan standar naftalen dengan konsentrasi 2 ppm, 5 ppm, 100 ppm, 1000 ppm dan 1200 ppm
untuk diinjeksikan ke chromatografi gas. Sebanyak 0,1203 gr naftalen dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml kemudian ditambahkan n-heksan sampai garis batas. Larutan
naftalen dihomogenkan dengan membolak-balik labu takar sehingga diperoleh larutan 19
Universitas Sumatera Utara
33 naftalen dengan konsentrasi 1200 ppm. Sebanyak 0,1007 gram naftalen dimasukkan
ke dalam labu takar 10 ml kemudian ditambahkan n-heksan sampai garis batas. Larutan naftalen dihomogenkan dengan membolak-balik labu takar sehingga
diperoleh larutan naftalen dengan konsentrasi 1000 ppm. Sebanyak 1 ml larutan naftalen 1000 ppm tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml,
ditambahkan n-heksan hingga garis batas. Larutan tersebut dihomogenkan sehingga diperoleh larutan naftalen dengan konsentrasi 100 ppm. Untuk membuat larutan
naftalen dengan konsentrasi 2 ppm, larutan naftalen konsentrasi 100 ppm dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu takar ukuran 50 ml. Kemudian
ditambahkan n-heksan sampai garis batas dan dihomogenkan sehingga diperoleh larutan naftalen dengan konsentrasi 2 ppm. Untuk membuat larutan naftalen dengan
konsentrasi 5 ppm, larutan naftalen konsentrasi 100 ppm dipipet kembali sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam labu takar ukuran 20 ml. Kemudian ditambahkan n-
heksan sampai garis batas dan dihomogenkan sehingga diperoleh larutan naftalen dengan konsentrasi 5 ppm. Masing-masing larutan naftalen dengan konsentrasi 2 ppm,
5 ppm, 100 ppm, 1000 ppm dan 1200 ppm diinjeksikan sebanyak 1 µl ke dalam chromatografi gas. Setelah diperoleh luas area dari masing-masing konsentrasi
tersebut, dibuat kurva standar chromatografi gas dengan memplot konsentrasi versus luas area Basset et al., 1994. Dari kurva tersebut diperoleh persamaan:
Y = a + bX
Dimana: Y : Luas area
X : Konsentrasi naftalen ppm
a : intersep
b : slope
Nilai luas area dari masing-masing sampel disubstitusikan ke persamaan kurva standar chromatografi gas sehingga diperoleh nilai konsentrasi naftalen tersisa dari masing-
masing sampel. Alur pembuatan kurva standar naftalen untuk kromatografi gas dapat dilihat pada lampiran D.
20
Universitas Sumatera Utara
34
3.4.4 Screening Aktivitas Biosurfaktan
Untuk screening aktivitas biosurfaktan digunakan Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor, yaitu isolat bakteri dan setiap perlakuan diulangi sebanyak tiga
kali. Bakteri yang mampu mendegradasi naftalen diuji kemampuannya dalam menghasilkan biosurfaktan dengan metode Drop Collapsing Test yang dimodifikasi
Jain, et al., 1991. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 dekstrose. Sebanyak 2 ml inokulum cair masing-masing isolat
bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan standar Mac Farland ≈10
8
selml diinokulasikan ke dalam media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 dekstros
secara aseptis, lalu diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas waterbath shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari. Aktivitas
emulsifikasi dari supernatan media yang sudah dipisahkan dari bakterinya ditentukan dengan menambahkan 4,0 ml cairan supernatan dan 4,0 ml n-heksan pada
2,0 ml aquades. Larutan tersebut selanjutnya divorteks selama 10 detik, didiamkan selama 1 menit dan diamati terbentuknya kekeruhan dari adanya emulsi yang stabil
Siegmun Wagner, 1991. Kemudian emulsi yang terbentuk diukur ketebalannya dengan menggunakan jangka sorong. Alur kerja screening aktivitas biosurfaktan dapat
dilihat pada lampiran F. Analisa data dilakukan dengan metode ANOVA Analisys of Varian.
3.4.5 Uji Potensi Bakteri dalam Memproduksi Biosurfaktan 3.4.5.1 Produksi Biosurfaktan dan Kuantifikasi
Media pertumbuhan yang memacu produksi biosurfaktan membutuhkan ratio C:N yang tinggi Guerra-Santos et al, 1984. Oleh karena itu, untuk memacu agar bakteri
memproduksi biosurfaktan maka bakteri ditumbuhkan pada media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 naftalen sebagai satu-satunya sumber karbon. Sebanyak
2 ml inokulum cair masing-masing isolat bakteri yang setara dengan kekeruhan larutan standar Mac Farland
≈10
8
selml diinokulasikan ke dalam media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2 naftalen secara aseptis, lalu diinkubasi pada suhu
30ºC dengan digoyang di atas waterbath shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 21
Universitas Sumatera Utara
35 150 rpm selama 15 hari. Konsentrasi biosurfaktan yang terbentuk dianalisis dengan
metode orsinol yang dimodifikasi Chandrasekaran BeMiller, 1980; Koch et al., 1991. Media cair hasil inkubasi disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10
menit untuk memisahkan media dengan bakterinya dan diambil supernatannya. Sebanyak 4 ml supernatan diekstrak dengan 2 ml diethylether selama 5 menit,
ekstraksi ini diulangi 3 kali. Lapisan ether diambil, dikeringkan dan dilarutkan kembali dalam 2 ml 0,05 M sodium bikarbonat, kemudian larutan tersebut divorteks
dan ditambah dengan 3,6 ml larutan orsinol, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada temperatur kamar selama 15 menit, kemudian dianalisa dengan spektrofotometer
UV-Visibel Shimadzu 1240 dengan panjang gelombang 421 nm. Konsentrasi biosurfaktan dihitung dengan menggunakan kurva standar rhamnosa dan
diekspresikan dalam satuan ppm. Alur kerja produksi biosurfaktan dan kuantifikasi dapat dilihat pada lampiran H.
3.4.5.2 Penentuan Kurva Standar Rhamnosa
Kurva standar rhamnosa dibuat dengan menggunakan biosurfaktan dari jenis rhamnosa yang diperoleh dari Sigma Aldrich Company, Amerika Serikat. Larutan
rhamnosa dibuat dengan konsentrasi yang berbeda-beda yang dilarutkan dengan larutan sodium bikarbonat NaHCO
3
0,05M. larutan rhamnosa dibuat dengan konsentrasi 0 blanko, 10 ppm, 50 ppm, 80 ppm dan 400 ppm, kemudian masing-
masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml. masing-masing larutan tersebut ditambah 3,6 ml larutan orsinol Komposisi larutan orsinol dapat dilihat pada
lampiran I, dipanaskan hingga mendidih, didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit dan dianalisa dengan spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu 1240 dengan
panjang gelombang 421 nm Chandrasekaran BeMiller, 1980; Koch et al., 1991. Persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa ditentukan dengan metode Least
Square menurut Glover Mitchell 2002 dengan rumus: 22
Universitas Sumatera Utara
36 Y = a + bX
Dimana a : intersep
a = y – bx
b : slope
b = n ∑ xy ∑ x ∑ y
n ∑ x
2
∑ y
2
y : absorbansi
x : konsentrasi
Alur kerja penentuan kurva standar rhamnosa dapat dilihat pada Lampiran G. 23
Universitas Sumatera Utara
37
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Biosurfaktan dari Laut Belawan