3.4.1. Pembuatan Kurva Tumbuh Pichia stipitis 3.4.1.1. Penyiapan Kultur Murni Pichia stipitis
Kultur murni Pichia stipitis dari ITB dibiakan terlebih dahulu pada media glukosa, yeast extract, pepton, dan bacto agar
GYPA sebagai stock kultur Pichia stipitis
. Media agar miring tersebut dibuat dengan cara menimbang 2 gram glukosa; 0,5 gram yeast extract; 1 gram pepton; dan 2 gram bacto agar, kemudian
dilarutkan dengan 100 ml aquadest dan diaduk sambil dipanaskan sampai semua bahan larut. Medium dimasukan ke dalam tabung reaksi lalu disterilisasi dengan
autoklaf selama ±20 menit. Medium yang telah steril didinginkan dengan cara tabung dimiringkan. Lampu UV dan blower laminar transfer box dinyalakan
selama ±20 menit. Sebanyak 1 ose Pichia stipitis diinokulasikan dengan kawat ose secara aseptis pada media agar miring GYPA. Agar miring tersebut kemudian
diinkubasikan selama ±48 jam di dalam inkubator pada suhu 27
o
C. Pichia stipitis dalam GYPA ini disimpan di kulkas sebagai stock kultur Pichia stipitis.
3.4.1.2. Peremajaan Pichia stipitis pada Media Agar Miring YPMXA
Komposisi media agar miring YPMXA yeast extract, pepton, malt extract
, xilosa, dan bacto agar dibuat dengan komposisi 3 gl, 5 gl, 3 gl, 30 gl
dan 20 gl seperti pada penelitian Susanto dan Achmad 2003. Prosedur pembuatan agar miring steril dibuat seperti pada pembuatan media agar miring
GYPA. Sebanyak 1 ose isolat Pichia stipitis dari media stock kultur diinokulasikan pada media agar miring YPMXA steril, kemudian dinkubasikan
pada suhu 27
o
C selama ±48 jam.
3.4.1.3. Penanaman Pichia stipitis pada Media Cair YPMX
Komposisi media cair YPMX yaitu 3 gl, 5 gl, 3 gl, dan 30 gl Susanto dan Achmad, 2003. Medium dibuat dengan cara menimbang 3 gram yeast
extract ; 5 gram pepton; 3 gram malt extract; 30 gram xilosa dan dilarutkan dengan
aquadest sampai 1000 ml dan diatur derajat keasamannya dengan NaOH 0,1 N
dan HCl 0,1 N pada kondisi pH 4,5 dan 5. Media tersebut disterilisasi menggunakan autoklaf pada temperatur 121
o
C selama ±20 menit. Sebanyak masing-masing 2,5 ml larutan biakan Pichia stipitis berumur ±48 jam
diinokulasikan kedalam 2 buah erlemeyer 100 ml yang masing-masing berisi 22,5 ml medium cair YPMX steril pH 4,5 dan 5, kemudian diinkubasikan pada suhu
27
o
C dan diagitasi dengan rotary shaker pada 120 rpm selama 24 jam. Sebanyak 15 ml biakan tersebut kemudian diinokulasikan lagi kedalam erlemeyer 300 ml
yang berisi 135 ml media cair YPMX steril dan diinkubasikan pada suhu 27
o
C dan diagitasi dengan rotary shaker pada 120 rpm. Selanjutnya setiap 2 jam sekali
sampel biakan Pichia stipis diambil sebanyak 2 ml dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 600 nm
Susanto dan Achmad, 2003. Prosedur dilakukan dengan 3 kali ulangan.
3.4.1.4. Penentuan Kurva Tumbuh Pichia stipitis
Hasil sampling sampel biakan Pichia stipitis pada jam ke-0 sampai jam ke-26 divortex sampai bercampur rata. Selanjutnya spektrofotometer dinyalakan
dan diset panjang gelombangnya pada 600 nm dan dibiarkan selama 15 menit. Cuvette
diisi dengan media cair YPMX steril blanko kemudian bagian luar cuvette
dibersihkan bagian luarnya dengan tissue sampai jernih. Selanjutnya cuvette
dimasukan kedalam tube holder spektrofotometer ditutup dan ditekan tombol autozero. Setelah itu, sampel biakan Pichia stipitis yang telah divortex
dimasukan ke dalam cuvvette dan dibersihkan bagian luarnya dengan tissue sampai jernih. Cuvette dimasukan ke dalam tube holder spektrofotometer dan
ditekan tombol start pada alat. Hasil pengukuran dicatat dan dibuat kurva hubungan antara absorbansi dengan waktu sampling. Sampel yang telah diukur
absorbansinya kemudian diukur pH akhirnya dan dibuat hubungan antara perubahan pH media dengan waktu sampling. Replikasi dilakukan sebanyak 3
kali. Diagram alir pembuatan kurva tumbuh ini dapat dilihat pada lampiran 13.
3.4.2. Detoksifikasi Penguapan dan Penambahan Alkali pada Hidrolisat
