biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda. Tahap- tahap pewarnaan spora dapat dilihat pada Gambar 3.
Preparat bakteri pada gelas obyek Ditetesi pewarna hijau malachit dan dibiarkan
hingga kering dengan pemanasan
Dicuci hati-hati dengan air selama 20-30 detik Ditetesi safranin dan dibiarkan selama 30 detik
Dibilas dengan air dan dikeringkan Diperiksa di bawah mikroskop dengan minyak imersi
Gambar 3. Tahap-tahap pewarnaan spora 4 Uji pergerakan bakteri atau motilitas Fardiaz 1989
Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. Sifat pergerakan
ini biasanya ditandai dengan pertumbuhan yang menyebar atau tidak. Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis
menggunakan ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam Nutrient Broth yang mengandung agar 0,5 agar lunak. Selanjutnya
diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan bakteri tidak
menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak bergerak non motil.
3.4.6. Uji sifat fisiologi
Uji sifat-sifat fisiologi meliputi uji hidrolisis pati, uji hidrolisis protein, uji hidrolisis lemak, uji reduksi nitrat, uji indol, uji fermentasi gula, uji katalase, uji
oksidase, uji H
2
S, uji oksidatif-fermentatif Baird-Parker, uji kualitatif untuk Staphylococcu
s, uji koagulase, uji manitol dan pendugaan jenis bakteri. a Uji hidrolisis pati Lay 1994
Pengujian hidrolisis pati bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim amilase yang dapat memecah pati menjadi molekul
yang lebih sederhana. Pengujian ini dilakukan karena banyak bakteri yang mempunyai kemampuan untuk menghidrolisis pati.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi medium Starch Agar SA, dan diinkubasikan pada suhu 30ºC selama dua hari.
Pengamatan pada isolat yang diuji dilakukan dengan cara meneteskan larutan iodium pada koloni yang tumbuh. Uji aktivitas hidrolisis pati ini dikatakan
positif jika tidak terbentuk warna biru sewaktu penambahan larutan iodium ke dalam media.
b Uji hidrolisis protein Fardiaz 1989 Pengujian hidrolisis protein bertujuan untuk mengetahui adanya enzim
proteinase ekstraseluler pada bakteri, yang dapat memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida dan asam amino.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi Skim Milk Agar
SMA. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Uji dikatakan positif jika terbentuk areal bening disekeliling koloni.
c Uji hidrolisis lemak Fardiaz 1989 Pengujian hidrolisis lemak bertujuan untuk mengetahui adanya enzim
lipase pada bakteri. Enzim ini juga merupakan enzim ekstraseluler dan tergolong dalam kelompok esterase, yaitu enzim yang mampu menghidrolisis substansi yang
mengandung ikatan ester. Enzim lipase akan memecah lemak menjadi asam lemak dan gliserol.
Isolat yang akan diuji digoreskan pada setengah bagian cawan yang berisi Nutrien Agar
NA + 1 lemak + neutral red. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Koloni yang dapat menghidrolisis lemak menjadi gliserol dan
asam lemak akan menyebabkan terbentuknya warna merah pada bagian bawah koloni, dan hal ini menunjukkan uji aktivitas hidrolisis lemak positif.
d Uji katalase Fardiaz 1987 Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada
bakteri, dimana enzim ini berperan dalam memecah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap
kebutuhan akan oksigen.
Secara aseptis diambil satu ose kultur bakteri dari agar miring dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian diteteskan 1-3 tetes larutan H
2
O
2
3 . Adanya enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-gelembung kecil
oksigen yang terlihat seperti busa sabun. e Uji reduksi nitrat Hadioetomo 1985
Beberapa mikroorganisme mampu menggunakan molekul bukan oksigen sebagi akseptor elektron terakhir. Nitrat yang direduksi menjadi nitrit oleh
mikroorganisme tertentu digunakan sebagai akseptor elektron terakhir. Dalam uji reduksi nitrat, isolat yang akan diuji diinokulasikan ke dalam
Nitrat Broth . Setelah diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari, masing-masing
isolat yang akan diuji diberi tiga tetes larutan asam sulfanilat dan tiga tetes larutan dimetil-alfa-naftilamin. Bila dalam isolat yang diuji terdapat nitrit, maka akan
segera terbentuk warna merah, berarti uji nitrit positif. Bila tidak jelas perubahan warnanya, dapat ditambahkan sedikit serbuk seng kedalam tabung yang berisi
isolat yang diuji, dan bila terbentuk warna merah, berarti uji reduksi nitrat negatif, sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna berarti uji reduksi nitrat positif.
f Uji indol Hadioetomo 1985 Uji indol digunakan untuk mengetahui adanya enzim triptofanase pada
bakteri, dimana enzim triptofanase ini dapat menghidrolisis asam amino triptofan menjadi indol dan asam piruvat.
Dalam uji indol medium yang digunakan adalah medium Tryptone Broth semi padat. Isolat yang akan diuji diinokulasi ke dalam tabung reaksi yang berisi
Tryptone Broth semi padat dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari.
Setelah inkubasi, masing-masing tabung ditambahkan 0,5 ml pereaksi Kovac’s. Uji ini dikatakan positif jika terbentuk warna merah yang menunjukkan adanya
indol dalam medium. g Uji fermentasi gula dan H
2
S Fardiaz 1989 Uji fermentasi gula dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk
memfermentasi gula-gula tertentu dengan menghasilkan asam dan atau gas. Sedangkan uji H
2
S dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri untuk memecah sistin dan menghasilkan H
2
S.
Dalam uji fermentasi gula digunakan medium Triple Sugar Iron Agar TSIA. Isolat yang akan diuji diinokulasi pada agar miring TSIA dengan cara
membuat goresan pada agar miring dan menusukkannya pada bagian bawah agar. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama dua hari. Reaksi-reaksi yang terjadi
dapat diamati pada Tabel 3 dan 4. Tabel 3. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji fermentasi gula
Bagian bawah agar Bagian atas agar
reaksi warna reaksi
warna Keterangan
Basa Asam
Asam Merah
Kuning Kuning
- Basa
Asam Orange
Merah kuning
Tidak memfermentasikan gula Fermentasi glukosa
Fermentasi laktosa dan atau sukrosa
Sumber: Fardiaz 1989
Tabel 4. Reaksi-reaksi yang terjadi pada uji H
2
S
Bagian bawah agar Bagian atas agar
Keterangan Agar pecahterangkat keatas
Agar berwarna hitam -
- Produksi gas
Produksi H
2
S Sumber: Fardiaz 1989
h Uji oksidase Hadioetomo 1985 Uji oksidase merupakan salah satu uji yang cukup penting dalam
karakterisasi bakteri. Uji oksidase berfungsi untuk menentukan oksidase sitokrom yang biasanya terdapat pada mikroorganisme patogen.
Pada uji oksidase kultur bakteri ditumbuhkan pada medium Trypticase Soy Agar
TSA dan diinkubasi pada suhu 35ºC selama dua hari. Koloni yang tumbuh digenangi dengan pereaksi p-aminodimetil-anilin oksalat
1 . Uji positif ditandai dengan berubahnya koloni menjadi merah muda lalu merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam.
i Uji oksidasi-fermentatif Baird-Parker Baird-Parker 1969 diacu dalam Minor dan Marth 1976
Uji ini dilakukan untuk mengetahui metabolisme dari isolat bakteri yang diuji dilakukan dengan cara oksidatif atau fermentatif terhadap karbohidrat yang
ditambahkan.
Dalam uji oksidatif-fermentatif digunakan tryptone, yeast extract, glukosa, bromocresol blue
dan agar. Bakteri yang akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan ose diinokulasikan kedalam medium tegak yang sudah disiapkan
terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan diuji ditusukkan ke dalam dua tabung, tabung pertama ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa
parafin. Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama 48 jam. Bila terjadi perubahan warna terbentuk warna kuning pada kedua tabung, maka bakteri
bersifat fermentatif. Bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna terbentuk warna kuning maka bakteri bersifat oksidatif sedangkan bila tidak
terjadi perubahan warna pada kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif- fermentatif bersifat negatif.
j Uji kualitatif untuk Staphylococcus Fardiaz 1989 Uji ini digunakan untuk mengetahui dan memastikan bahwa isolat bakteri
yang diperoleh tergolong dalam jenis bakteri Staphylococcus sp. Dalam uji kualitatif untuk Staphylococcus digunakan medium
Baird-Parker Agar BPA yang dicampur dengan Egg Yolk steril. Isolat yang
akan diujikan digoreskan pada cawan yang telah berisi medium tersebut. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama dua hari. Uji dikatakan positif jika terbentuk
koloni bakteri berwarna hitam pada medium yang terkena goresan. k Uji koagulase Fardiaz 1989
Uji ini merupakan uji lanjutan dari uji kualitatif untuk Staphylococcus. Pada uji ini akan diketahu isolat yang diuji tergolong bakteri patogen atau tidak.
Dalam uji koagulase digunakan medium cair Brain Heart Infusion BHI. Bakteri yang akan diuji diinokulasikan dengan cara menusukkan jarum ose pada
medium cair steril BHI sebanyak 5 ml kemudian dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Inkubasi dilakukan pada suhu 37ºC selama dua hari,
setelah dua hari diambil 0,2 ml kultur dan ditambahkan 0,3 ml plasma kelinci, selanjutnya diinkubasi lagi pada suhu 37ºC selama satu sampai dua jam. Uji
koagulase positif ditandai dengan terbentuknya koagulasi seperti fibrin gumpalan yang berwarna putih bening.
l Uji manitol Lay 1994 Uji ini merupakan penguat dari uji koagulase yang digunakan untuk
membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen atau tidak patogen. Dalam uji manitol digunakan medium cair Manitol Broth + fenol red
di dalam tabung durham. Bakteri yang akan diuji diinokulasikan dengan cara mengambil satu ose isolat yang kemudian dimasukkan ke dalam medium cair
Manitol Broth . Inkubasi dilakukan pada suhu 30ºC selama dua hari. Uji
dikatakan positif jika terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning. Bila bakteri tersebut Staphylococcus aureus patogen maka akan membentuk zona
kuning sedangkan Staphylococcus yang bersifat tidak patogen akan membentuk zona merah.
m Pendugaan jenis bakteri Cowan 1981 Setelah dilakukan uji morfologi dan fisiologi, kelima isolat bakteri tersebut
diduga jenisnya dengan menggunakan tabel identifikasi dari Cowan 1981. Tabel identifikasi Cowan 1981 dapat dilihat pada Tabel 5 dan 6.
TABEL ADA DI MICROSOFT EXCEL
4. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Analisis Bahan
Tahap awal yang dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis bahan. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui kondisi fisik dan karakteristik sampel
sebagai informasi awal sebelum dilakukan isolasi dan karakterisasi bakteri yang terdapat di dalamnya. Sampel yang diukur adalah peda merah dari ikan kembung
perempuan Rastrelliger neglectus yang diperoleh dari pasar Lawang Seketeng Bogor. Ikan peda tersebut merupakan hasil produksi dari pengolah ikan peda di
daerah Indramayu dan produk tersebut telah mengalami proses fermentasi dan penyimpanan ± 2 bulan. Sampel peda merah ikan kembung perempuan
Rastrelliger neglectus dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Sampel peda merah ikan kembung perempuanRastrelliger neglectus
Pada tahap analisis bahan dilakukan pengukuran kadar garam, derajat keasaman pH dan perhitungan nilai Total Plate Count TPC dari sampel. Hasil
pengukuran yang diperoleh dari tahap ini dapat dilihat pada Tabel 7 dan hasil perhitungannya dapat dilihat pada Lampiran 2, 3 dan 4.
Tabel 7. Kadar garam, pH dan nilai Total Plate Count TPC ikan peda merah
No Jenis pengukuran
Hasil
1. kadar garam
11,4 2. pH
derajat keasaman
7,08 3. nilai
Total Plate Count TPC
1,04 x 10
4
koloniml
