Isolasi bakteri dari sampel Fardiaz 1988 Uji sifat morfologi

3.4.3. Perhitungan nilai Total Plate Count Fardiaz 1992

Perhitungan nilai TPC digunakan untuk mengetahui mutu suatu bahan pangan. Koloni yang tumbuh dapat juga digunakan untuk isolasi serta identifikasi bakteri karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu bakteri yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik. Sampel ikan peda dihancurkan dalam mortar porselen untuk mendapatkan kondisi sampel yang homogen. Selanjutnya sampel sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam 90 ml larutan pengencer steril secara aseptis untuk mendapatkan pengenceran 10 -1 . Untuk pengenceran 10 -2 diambil 1 ml suspensi contoh dari tabung pengencer 10 -1 dan dimasukkan ke dalam tabung pengencer yang lain yang berisi 9 ml larutan pengencer, kemudian sampel dikocok sampai homogen. Hal yang sama dilakukan sampai mendapatkan pengenceran 10 -5 . Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dilakukan dengan metode tuang pour plate. Dari setiap tingkat pengenceran, masing-masing diambil 1 ml suspensi sampel yang dimasukkan ke dalam cawan petri. Kemudian ke dalam cawan petri ditambahkan medium Nutrien Agar NA yang telah steril sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampel menyebar rata. Medium NA yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri ini telah ditambahkan garam NaCl murni yang sesuai dengan kadar garam yang terkandung di dalam sampel. Setelah itu cawan petri diinkubasikan pada suhu kamar selama dua hari. Koloni yang tumbuh diamati dan dihitung jumlahnya untuk mendapatkan nilai Total Plate Count TPC. Cara perhitungan TPC adalah sebagai berikut: TPC koloniml = Jumlah koloni per cawan x n pengencera faktor 1

3.4.4. Isolasi bakteri dari sampel Fardiaz 1988

Isolasi dan pemurnian bakteri bertujuan memisahkan koloni-koloni bakteri yang masih tercampur hingga diperoleh suatu isolat murni. Pada tahap pemurnian koloni bakteri yang dianggap terpisah dipisahkan dengan cara penggoresan kuadran. Berdasarkan hasil pengamatan setelah tahap perhitungan TPC, koloni bakteri yang tampak berbeda dari koloni yang dominan masing-masing diambil untuk dikulturkan ke media NA yang telah ditambahkan NaCl sebanyak 11,4 yang berbentuk agar miring, sebelumnya dilakukan pengamatan terhadap morfologi koloni terpilih bentuk, tepian, elevasi dan warna. Kultur bakteri bakteri tersebut diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar 30ºC. Isolasi atau pemurnian dilakukan pada agar cawan dengan menggunakan metode goresan kuadran. Kultur bakteri di dalam agar miring yang diperoleh setelah dilakukan uji morfologi sel pewarnaan Gram, spora dan bentuk sel digoreskan secara kuadran ke medium NA padat steril kemudian diinkubasi selama dua hari. Dengan metode goresan kuadran ini diharapkan akan diperoleh koloni terpisah kemudian dilakukan pengkulturan koloni terpilih pada agar miring. Selanjutnya, tabung diinkubasi pada suhu kamar selama dua hari dan dilakukan uji morfologi sel pewarnaan Gram, spora dan bentuk sel kembali. Isolasi dan pemurnian ini dilakukan beberapa kali sampai didapat isolat yang benar-benar murni Setelah didapatkan koloni yang benar-benar terpisah, biakan murni tersebut ditumbuhkan atau disimpan dalam agar miring dan disegarkan secara berkala 1 minggu sekali.

3.4.5. Uji sifat morfologi

Untuk mengetahui sifat-sifat morfologi dari isolat bakteri yang diperoleh dilakukan pengamatan morfologi koloni dan morfologi selnya. a Morfologi koloni Pengamatan morfologi koloni dilakukan untuk mengetahui bentuk koloni dari atas, bentuk tepi, bentuk elevasi dan warna koloni secara visual Lampiran 1. b Morfologi sel Uji morfologi sel meliputi pengamatan bentuk sel, pewarnaan Gram, pewarnaan spora dan uji pergerakan bakteri atau motilitas. Prosedur penyiapan olesan bakteri preparat bakteri yang baik merupakan syarat untuk melakukan pewarnaan, baik pewarnaan Gram maupun spora. Langkah pertama yaitu satu sampai dua mata ose air steril atau air suling diletakkan pada gelas obyek, lalu diambil satu sampai dua mata ose biakan bakteri kemudian dihomogenkan. Kemudian olesan dibiarkan kering oleh udara dan difiksasi dengan panas agar bakteri tersebut mati. 1 Bentuk sel Berdasarkan hasil preparat bakteri yang telah dibuat diamati bentuk selnya secara mikroskopik sehingga dapat diketahui bentuknya kokus, batang atau spiral. 2 Pewarnaan Gram Fardiaz 1989 Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara mengamati sel-sel bakteri yang telah mati dan diwarnai. Dengan cara tersebut, bentuk sel akan menjadi lebih jelas karena warna sel dibuat kontras dengan medium disekelilingnya sehingga lebih mudah dilihat dibawah mikroskop. Bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil akan mudah dilihat. Pada pewarnaan Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu zat warna basa kristal violet, larutan iodium lugol, alkohol dan safranin. Preparat bakteri ditetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan selama satu menit, kemudian dibilas dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan lugol dan dibiarkan selama satu menit, dicuci dengan air dan dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 96 selama 10-20 detik atau sampai warna ungu tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar kemudian diwarnai dengan larutan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air, kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop menggunakan minyak imersi dan diamati bentuk sel serta reaksi Gram. Sel-sel bakteri yang tidak dapat melepaskan warna akan tetap berwarna seperti warna violet kristal yaitu biru ungu disebut bakteri Gram positif. Sel-sel bakteri yang dapat melepaskan violet kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah atau merah muda disebut bakteri Gram negatif. Tahap-tahap pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar 2. Preparat bakteri pada gelas obyek Ditetesi pewarna kristal violet, dibiarkan 1 menit, dibilas dengan air Ditetesi larutan lugol 1 menit, dibilas dengan air Ditetesi alkohol 96 10-20 detik atau sampai warna ungu tidak luntur lagi, dibilas dengan air Ditetesi safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik Dibilas dengan air dan dikeringkan Diperiksa di bawah mikroskop dan diamati bentuk sel dan reaksi Gram Gambar 2. Tahap-tahap pewarnaan Gram 3 Pewarnaan spora Hadioetomo 1985 Pewarnaan spora merupakan pewarnaan yang bertujuan melihat adanya suatu struktur di dalam sel bakteri yang disebut endospora. Jika sel semakin tua, maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan terlepas menjadi spora bebas. Berbeda dengan sel vegetatif, spora akan lebih tahan lama dalam keadaan lingkungan yang ekstrim. Pada prinsipnya pewarnaan ini digunakan untuk membedakan spora dari sel vegetatif. Zat warna yang biasa digunakan adalah malachite green dan safranin. Mula-mula pewarna hijau malachit diteteskan di atas preparat bakteri dan dibiarkan hingga kering dengan pemanasan. Setelah kering, preparat dicuci hati- hati dengan air selama 20-30 detik kemudian diberi safranin dan dibiarkan selama 30 detik, dibilas dengan air dan dikeringkan dengan kertas serap. Sel kemudian diperiksa di bawah mikroskop dengan menggunakan minyak imersi. Endospora yang masih terdapat dalam sel vegetatif maupun spora bebas akan berwarna hijau biru, sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah sampai merah muda. Tahap- tahap pewarnaan spora dapat dilihat pada Gambar 3. Preparat bakteri pada gelas obyek Ditetesi pewarna hijau malachit dan dibiarkan hingga kering dengan pemanasan Dicuci hati-hati dengan air selama 20-30 detik Ditetesi safranin dan dibiarkan selama 30 detik Dibilas dengan air dan dikeringkan Diperiksa di bawah mikroskop dengan minyak imersi Gambar 3. Tahap-tahap pewarnaan spora 4 Uji pergerakan bakteri atau motilitas Fardiaz 1989 Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. Sifat pergerakan ini biasanya ditandai dengan pertumbuhan yang menyebar atau tidak. Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis menggunakan ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam Nutrient Broth yang mengandung agar 0,5 agar lunak. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak bergerak non motil.

3.4.6. Uji sifat fisiologi