Jenis dan Rancangan Penelitian aureus dan E. coli dengan metode dilusi cair

24

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni, dengan rancangan acak lengkap pola searah. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan Laboratorium Mikrobiologi Balai Kesehatan Yogyakarta.

B. Variabel dan Defenisi Operasional

1. Variable penelitian

a. Variabel bebas : konsentrasi ekstrak etanol kulit buah petai. b. Variabel tergantung : diameter zona hambat. c. Variabel pengacau terkendali : asal tanaman, cara ekstraksi, lamanya waktu inkubasi, suhu inkubasi, jenis mikroba uji, volume larutan uji yang diinokulasikan. 2. Definisi operasional a. Aktivitas antibakteri adalah kemampuan ekstrak etanol kulit buah petai untuk menghambat mikroba uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang dibandingkan dengan kontrol negatif DMSO 5 sebagai pelarut. b. Kulit buah petai adalah kulit yang melindungi biji buah petai dan berwarna hijau dari buah yang sudah dapat dipanen. c. Zona hambat adalah zona jernih di sekitar sumuran pada media yang ditambah ekstrak etanol kulit buah petai, tidak menunjukkan pertumbuhan koloni bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dilihat dari kejernihan media yang dibandingkan dengan kontrol negatif DMSO 5. d. Kontrol negatif atau kontrol pelarut adalah DMSO 5 yang digunakan sebagai pelarut ekstrak dan pembanding dalam uji aktivitas antibakteri. e. Kadar Hambat Minimum KHM adalah konsentrasi terendah ekstrak etanol kulit buah petai yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dilihat adanya pertumbuhan bakteri pada uji penegasan penentuan KHM dan KBM. f. Kadar Bunuh Minimum KBM adalah konsentrasi terendah ekstrak etanol kulit buah petai yang dapat membunuh bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dilihat dari kejernihan pada media uji penegasan penentuan KHM dan KBM.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah serbuk kulit buah petai Parkia speciosa Hassk. diperoleh dari Merapi Farma Herbal, kultur murni bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang diperoleh dari Balai Kesehatan Yogyakarta, media Mueller Hinton Agar MHA dan Mueller Hinton Broth MHB dari Merck, larutan standar Mac Farland 0,5 1,5 x 10 8 CFUmL, aquadest steril, etanol 70, amoksisilin, dimetil sulfoksida DMSO dari Merck.

2. Alat

Alat-alat yang digunakan adalah inkubator Heraeus, oven, autoclave, microbiological safety cabinet MSC, spektrofotometer Uv-Vis Shimadzu, waterbath Memmert, platform shaker Innova 2100 New Brunswick Scientific, rotary evaporator, Moisture balance HG53 Halogen Moisture Analyzer, timbangan digital, vortex, Erlenmeyer, tabung reaksi, corong, labu ukur, pipet tetes, cawan petri, batang pengaduk, gelas ukur, sendok, pelubang sumuran diameter 6 cm, ayakan tepung, kertas saring, Bunsen, jarum ose, flakon, mikropipet Socorex.

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi kulit buah petai

Determinasi dilakukan di CV Merapi Farma Herbal Yogyakarta. Kulit buah petai dideterminasi secara makroskopis dengan mencocokkan ciri - ciri yang ada pada tanaman dan disertai dengan surat keterangan keaslian tanaman dari CV Merapi Farma Herbal Yogyakarta.

2. Pengumpulan kulit buah petai

Kulit buah petai diambil dari Kabupaten Sleman dan kulit buah petai yang diambil berwarna hijau yang membungkus biji petai tidak termasuk selaput biji.

3. Pengeringan dan pembuatan serbuk kulit buah petai

Kulit buah petai yang telah dikumpulkan dicuci bersih dari kotoran menggunakan air mengalir. Kulit buah petai dikeringkan pada ruang pengering simplisia. Pengeringan dihentikan jika kulit buah petai saat diremas mudah remuk, kemudian diserbuk dengan menggunakan mesin seperti penggiling kopi hingga halus dan diayak menggunakan ayakan tepung. Kemudian serbuk disimpan dalam wadah kering dan tertutup rapat.

4. Penetapan susut pengeringan serbuk kulit buah petai

Serbuk kulit buah petai yang telah diperoleh dilakukan susut pengeringan menggunakan moisture balance HG53 Halogen Moisture Analyzer. Susut pengeringan dilakukan dengan menimbang 5 gram serbuk pada moisture balance lalu diukur selama 15 menit dengan suhu 105 o C dan hasil pengukuran dinyatakan dalam persen.

5. Pembuatan ekstrak etanol kulit buah petai

Pembuatan ekstrak etanol kulit buah petai Parkia speciosa Hassk. menggunakan metode maserasi dengan perbandingan 1 : 10 bagian. Maserasi pertama dengan perbandingan 1 : 7,5 bagian sebanyak 50 g serbuk kering simplisia dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian diberi pelarut etanol 70 sebanyak 375 mL. Maserasi dilakukan selama 2 x 24 jam dengan bantuan shaker. Setelah itu ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan corong Buchner, kertas saring dan pompa vakum. Kemudian, hasil sarinya diremaserasi menggunakan pelarut etanol sebesar 125 mL dan didapatkan maserat II, lalu maserat I dan II dapat digabung. Maserat yang diperoleh dapat dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator dengan suhu 70 o C sampai terbentuk cairan kental. Selanjutnya, diuapkan dengan menggunakan penangas air pada suhu antara 50-60 o C sampai diperoleh ekstrak kental dengan bobot tetap.

6. Identifikasi kandungan senyawa kimia kulit buah petai dengan uji tabung

a. Pembuatan larutan uji fitokimia Pembuatan larutan uji untuk uji fitokimia dilakukan dengan cara melarutkan sebanyak 500 mg ekstrak etanol kulit buah petai dalam 50 mL etanol 70. b. Skrinning Fitokimia 1 Uji pendahuluan Dua gram serbuk kulit buah petai ditambah dengan 20 mL aquadest lalu dipanaskan di atas waterbath selama lebih kurang 15 menit, lalu disaring. Jika larutan berwarna merah atau kuning dan saat penambahan KOH LP, warna larutan menjadi lebih intensif menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor dengan gugus hidrofilik. 2 Uji Saponin Sebanyak 100 mg serbuk kulit buah petai ditambahkan 10 mL aquadest ke dalam tabung reaksi, ditutup dan dikocok selama 30 detik. Tabung dibiarkan dalam posisi tegak selama 30 menit. Apabila terbentuk buih dari permukaan cairan dan setelah lebih kurang 30 menit ditetesi lebih kurang 1 tetes HCl 2 N, busa tidak hilang maka menunjukkan adanya saponin Depkes RI, 1995. 3 Uji Flavonoid Sebanyak 3 mL larutan uji ditetesi dengan NaOH LP lebih kurang 2 tetes dan kemudian warna larutan uji menjadi warna kuning pekat. Dengan penambahan HCl, intensitas warna kuning berubah. Perubahan ini mengindikasikan adanya flavonoid Jones and Kinghorn, 2006. 4 Uji Alkaloid Sebanyak 2 mL larutan uji diuapkan di atas porselin dan penangas air lebih kurang 5 menit, lalu dilarutkan dengan 5 mL HCl 2 N. Kemudian, larutan yang diperoleh dibagi dalam 3 tabung reaksi yaitu : blanko larutan uji yang telah diuapkan ditambah HCl 2N; blanko ditambah 3 tetes pereaksi Dragendorff; dan blanko ditambah 3 tetes pereaksi Mayer. Apabila terdapat endapan jingga setelah ditambah Dragendorff dan endapan kuning setelah ditambah Mayer menunjukkan adanya alkaloid Jones and Kinghorn, 2006. 5 Uji Tanin Sebanyak 1 mL larutan uji dilarutkan dengan FeCl 3 10 lebih kurang 3 tetes. Adanya tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan Jones and Kinghorn, 2006. 6 Uji Fenolik Sebanyak 3 mL larutan uji ditambahkan beberapa tetes lebih kurang 6 tetes larutan FeCl 3 1. Hasil positif berwarna hijau, merah, ungu atau hitam Jones and Kinghorn, 2006. 7 Uji terpenoid Sebanyak 2,5 mL larutan uji dicampur dengan 1 mL kloroform dan ditambah 1,5 mL H 2 SO 4 pekat secara hati-hati lewat dinding. Hasil positif ditunjukkan dengan larutan menjadi warna coklat kemerahan pada permukaan dalam larutan Edeoga, Okwu, and Mbaebre, 2005 .

7. Uji penentuan nilai KHM dan KBM ekstrak etanol kulit buah petai terhadap

S. aureus dan E. coli dengan metode dilusi cair

a. Pembuatan variasi konsentrasi larutan uji

Ekstrak kental kulit buah petai dilarutkan dengan DMSO 5 diperoleh konsentrasi 50, kemudian dilakukan pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi 25; 12,5; 6,25; 3,125. Sebagai kontrol negatif digunakan DMSO 5 dan sebagai kontrol positif digunakan amoksisilin 125 mg5 mL untuk Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. b. Identifikasi bakteri uji

1 Staphylococcus aureus

Bakteri ditanam ke media geolitik lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C, setelah diinkubasi 24 jam dan terdapat endapan hitam pada media geolitik maka menunjukkan bahwa bakteri yang diidentifikasi adalah Staphylococcus aureus. Setelah 24 jam diinkubasi, bakteri diisolasi dari media geolitik ke media Enrich, lalu diinkubasi kembali selama 2 kali 24 jam pada suhu 37 C, jika terdapat endapan hitam dengan kabut putih setelah diinkubasi menunjukkan bahwa bakteri yang diidentifikasikan adalah Staphylococcus aureus. Kemudian, diambil 1-2 ose bakteri, diinokulasi ke dalam media gula- gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa, media NA miring, media Simons Citrate SC, media Sulfure Indole Motil SIM dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam, dilakukan pengecatan gram.

2 Escherichia coli

Bakteri ditanam ke media BGLB Brilliant Green Lactose Bile lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 44 o C. Setelah diinkubasi terdapat gelembung gas dari tabung Durham yang ada di dalam tabung reaksi, maka menunjukkan bahwa bakteri yang diidentifikasi adalah Escherichia coli. Setelah diinkubasi 24 jam, bakteri diisolasi dan ditanam ke media TBX Tryptone Bile X-Glucuronide dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah diinkubasi 24 jam terdapat warna hijau pada media isolasi maka menunjukkan bahwa bakteri yang diuji adalah Escherichia coli. Kemudian, diambil 1-2 ose bakteri, diinokulasi ke dalam media gula-gula glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sakarosa, media Na miring, Simons Citrate SC, Sulfure Indole Motil SIM dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam, dilakukan pengecatan gram.

c. Pembuatan suspensi bakteri uji

Stok bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil 1 – 3 ose, lalu diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi MHB Mueller Hinton Broth dan divortex agar tercampur rata, lalu dilihat kekeruhannya dengan membandingkannya dengan Mac Farland 0,5 1,5 x 10 8 CFU. d. Uji aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi sumuran Media Mueller Hinton Agar MHA yang telah memadat pada petri dapat di streak oleh bakteri uji dengan menggunakan metode Kirby Bauer secara merata. Kemudian, sumuran dibuat menggunakan pelubang sumuran berdiameter 6 mm sebanyak 5 sumuran. Setiap lubang sumuran diinokulasikan dengan 50 L ekstrak etanol yang berkonsentrasi 50 bv; 25 bv; 12,5 bv; 6,25 bv dan 3,125 bv. Amoksisilin 125 mg5mL sebagai kontrol positif untuk Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, sedangkan DMSO 5 sebagai kontrol negatif dari ekstrak etanol. Petri-petri tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C kemudian diamati ada tidaknya zona hambat di sekitar sumuran. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan penggaris. Pada uji potensi antimikroba ini direplikasi sebanyak 3 kali untuk masing-masing ekstrak. e. Pengukuran KHM dengan metode dilusi cair Penentuan KHM dan KBM dilakukan dengan metode dilusipengenceran, media yang digunakan adalah MHB. Penentuan KHM dan KBM menggunakan 7 tabung reaksi, yang masing-masing berisi 5 mL media MHB. Setiap tabung reaksi yang berisi 5 mL media MHB steril, ditambahkan 200 L dari 7 seri konsentrasi ekstrak etanol kulit buah petai 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 ; 1,563 dan 0,782 ditambahkan 200 L suspensi bakteri. Tujuh tabung reaksi berisi 5 mL media MHB yang telah ditambahkan dengan 7 seri konsentrasi ekstrak etanol kulit buah petai dan suspensi bakteri, kemudian diukur Optical Density OD bakteri dengan menggunakan spektrofotometer 480 nm sebagai pembanding sebelum perlakuan atau kontrol. Tujuh tabung reaksi lainnya, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C dalam inkubator. Hasil inkubasi diukur Optical Density OD bakteri dengan menggunakan spektrofotometer 480 nm, sebagai pembanding sesudah perlakuan inkubasi. KHM ditentukan dengan membandingkan OD setelah perlakuan inkubasi dikurangi OD sebelum perlakuan. Apabila terdapat konsentrasi terendah yang menghambat pertumbuhan bakteri, ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan OD bakteri adalah ≤ 0, maka didapatkan Konsentrasi Hambat Minimal KHM atau Minimal Inhibitory Concentration MIC. Sedangkan untuk menentukan KBM, dilakukan uji lanjutan dengan cara mengambil 1-2 ose dari konsentrasi yang menunjukkan KHM, distreak ke media MHA steril. Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 o C. Setelah diinkubasi, dilihat apakah ada pertumbuhan atau tidak pada media yang distreak. Jika tidak terdapat pertumbuhan bakteri pada konsentrasi yang terkecil, maka diperoleh Kadar Bunuh Minimum KBM. Tetapi, jika terdapat pertumbuhan pada media yang streak, maka yang diperoleh adalah Kadar Hambat Minimum KHM.

E. Analisis Hasil