Ekstrak metanol kental kulit buah lemon dilarutkan dalam 300 ml air hangat dan dilakukan ekstraksi cair-cair menggunakan washbensin dengan
perbandingan larutan ekstrak : washbensin 1:1 vv, dihasilkan fraksi air dan washbensin. Kemudian fraksi air diekstraksi kembali menggunakan etil
asetat, sehingga didapatkan fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga didapatkan fraksi etil
asetat kental. Fraksi etil asetat ini yang digunakan untuk analisis selanjutnya.
5. Penetapan aktivitas antioksidan
a. Kualitatif Fraksi etil asetat ekstrak metanol kulit buah lemon dan standar rutin
masing-masing dilarutkan dalam metanol kemudian ditotolkan pada lempeng selulosa gel. Lempeng tersebut dielusi dengan fase gerak
kloroform : metanol 1:1 vv. Setelah dielusi, bercak diamati pada UV 365 nm dengan jarak rambat 10 cm. Pereaksi semprot yang digunakan
adalah uap ammonia dan besi III klorida. b. Kuantitatif
1. Pembutan larutan DPPH 0,4 mM Sebanyak 15,8 mg serbuk DPPH dimasukkan ke dalam labu
takar 100,0 ml, lalu ditambahkan metanol hingga batas tanda. Dihomogenkan dengan bantuan vortex untuk melarutkan DPPH.
2. Pembuatan larutan rutin 0,250 mgml Sebanyak 2,5 mg rutin dimasukkan dalam labu takar 10 ml,
masukkan metanol hingga batas tanda. Buat larutan pembanding dengan konse
ntrasi 12,25; 19,25; 26,25; 33,25; dan 40,25 gmL. 3. Pembuatan larutan uji aktivitas antioksidan
Ekstrak kulit buah jeruk lemonditimbang sebanyak 100 mg ditambahkan metanol sampai 25,0 ml. Larutan tersebut kemudian
dibuat larutan uji dengan konsentrasi 300,0; 350,0; 400,0; 450,0; dan 500,0 µgmL.
4. Penentuan operating time Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam
labu takar 5,0 ml, ditambahkan masing-masing 1 mL larutan pembanding rutin 12,25; 26,25; 40,25 µgmL. Kemudian tambahkan
metanol hingga batas tanda. Larutan dihomogenkan dengan vortex selama 30 detik. Setelah itu baca absorbansinya pada 517 nm tiap 10
menit selama 1 jam. Tentukan operating time reaksi. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 300; 400; 500 µgmL.
5. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum Pada 3 labu ukur 10 mL, dimasukkan masing-masing 12,12;
26,25, dan 40,25 µgmL larutan DPPH 0,4 mM. Setelah itu di add hingga batas tanda dan divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT.
Lalu dilakukan scanning panjang gelombang serapan maksimum
dengan spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 300; 400; 500 µgmL.
6. Penentuan aktivitas antioksidan Sebanyak 1,0 ml larutan DPPH 0,4 mM dimasukkan ke dalam
labu takar 5,0 ml kemudian ditambahkan 1,0 ml larutan uji atau pembanding pada berbagai konsentrasinya. Tambahkan metanol
hingga batas tanda. Larutan divortex selama 30 detik dan didiamkan selama operating time. Baca absorbansinya dengan spektrofotometer
visibel pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi. Pengujian dilakuakan dengan 3 kali replikasi.
Aktivitas antioksidan IC dihitung dengan rumus: IC =
-
x 100 7. Validasi metode uji aktivitas antioksidan
Hasil dari prosedur 6. divalidasi dengan parameter akurasi recovery, presisi CV, spesifitas spektra kontrol, dan linearitas
nilai r. Recovery
x 100 CV =
-
x 100
6. Penetapan kadar fenolik dalam ekstrak
