oven selama kurang lebih 6 jam. Setelah itu, didinginkan dalam desikator kemudian ditimbang. Contoh kembali dikeringkan dalam oven selama 30
menit lalu ditimbang kembali. Perlakuan terakhir ini diulangi terus hingga diperoleh berat sampel kering yang relatif konstan berat dianggap konstan
jika selisih berat sampel kering yang ditimbang ≤0,0003 gram.
W – W1 – W2 Kadar air =
x 100 W
W = bobot contoh sebelum dikeringkan g W1 = bobot contoh + cawan sesudah dikeringkan g
W2 = bobot cawan kosong g
3. Analisis Total Fenol Shetty et al., 1995 yang dikutip oleh Ishartani,
2004
Penentuan total fenol bertujuan mengetahui kandungan senyawa fenol pada sampel. Sampel kering beku bubuk mula-mula diambil
sebanyak 50.0 mg dan dilarutkan dalam 2.5 ml etanol 95, kemudian divorteks. Setelah itu dilakukan sentrifuse terhadap campuran tersebut
selama 5 menit dengan kecepatan putaran 4000 rpm. Supernatan diambil sebanyak 0.5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian
ditambahkan 0.50 ml etanol 95, 2.5 ml aquadest, dan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteu 50. Campuran tersebut didiamkan dahulu selama
5 menit, lalu ditambahkan 0.5 ml Na
2
CO
3
5 dan divorteks. Setelah itu, sampel disimpan dalam ruang gelap selama satu jam, lalu dilakukan
pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm. Prosedur penetuan total fenol dapat dilihat secara ringkas pada Gambar 15.
Standar yang digunakan dalam penentuan total fenol adalah asam galat. Standar asam galat dibuat dengan variasi konsentrasi antara
50-250 mgL.
4. Ekstraksi Senyawa Flavonoid dari Sayuran Indigenous Hertog et al.
a, 1992
Tahap ekstraksi sampel diawali dengan pelarutan sebanyak 0.500 atau 1.000 gram sampel kering beku ke dalam 40 ml metanol 62,5 dan
2 gL TBHQ sebagai antioksidan. Kemudian ditambahkan 10 ml HCl 6M lalu direfluks selama satu jam pada suhu 50
°C. Tujuan penambahan asam ini adalah untuk menjaga komponen agar tidak terdegradasi dan
perefluksan untuk hidrolisis asam guna memotong gula. Gula yang menempel pada flavonoid dapat mengganggu pemisahan komponen,
sehingga ikatan tersebut perlu dipotong. Setelah didinginkan ditambahkan kembali metanol sampai volume larutan menjadi 100 ml. Sebanyak dua
mililiter larutan disaring dengan filter syringe berdiameter 0.45 µm, dan sampel tersebut telah siap untuk diinjeksikan ke kolom HPLC. Gambar 16
menunjukkan secara ringkas proses pembuatan ekstrak sampel.
5. Analisis Flavonoid dengan HPLC
a. Pembuatan larutan standar Hertog et al. a, 1992 Sebanyak 1.5 mg standar yang tersedia dilarutkan dalam 3 ml
metanol 62.5, sehingga diperoleh standar stock dengan konsentrasi 500 µgml. Setelah itu, 2.5 ml dari standar stock dilarutkan dalam 20
ml metanol 62.5 dan 2 gL TBHQ. Kemudian dicampurkan dengan 5 ml HCl 6M untuk menjaga kondisi asamnya supaya komponen
flavonoid tersebut tidak terdegradasi. Penambahan metanol dilakukan hingga volume mencapai 50 ml, sehingga konsentrasi yang diperoleh
adalah 25 µgml. Larutan standar yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas lima konsentrasi, yaitu 0.5, 2.5, 10, 20, dan 25 µgml.
Pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 0.5, 2.5, 10, dan 20 µgml dilakukan dengan melakukan pengenceran dari larutan standar
yang memiliki konsentrasi 25µgml. Proses pembuatan larutan standar yang dibutuhkan pada penelitian ini dapat dilihat secara ringkas pada
Gambar 17. Larutan standar campuran dibuat dengan mencampur
kelima standar yang ada, dimana konsentrasi apigenin dibuat menjadi dua kali konsentrasi standar lainnya.
b. Injeksi larutan standar ke kolom HPLC Hertog et al. a, 1992 Larutan standar dengan berbagai konsentrasi tersebut
diinjeksikan ke kolom HPLC C-18 phase; Develosil ODS-UG-3 yang memiliki dimensi panjang 75 mm dan diameter dalam 4.6 mm. Fase
gerak yang digunakan adalah 25 acetonitril di dalam KH
2
PO
4
0.025 M, dengan laju aliran 0,9 mlmenit. Diinjeksikan pula larutan standar campuran pada berbagai konsentrasi.
c. Pembuatan kurva standar Hasil dari kromatogram standar pada berbagai konsentrasi
tersebut kemudian dimasukkan ke dalam satu grafik. Dari data-data masing-masing, dibuat persamaan garis yang akan digunakan pada
perhitungan Limit of Detection masing-masing standar. Dari data-data kromatogram standar campuran, dibuat persamaan garis yang
digunakan pada perhitungan kandungan komponen flavonoid pada sampel.
d. Perhitungan limit deteksi Rounds dan Nielsen, 2000 Limit of Detection LOD atau limit deteksi diperoleh
dengan cara menginjeksikan masing-masing standar sebanyak sepuluh kali. Konsentrasi yang digunakan untuk menentukan LOD adalah
konsentrasi yang terndah. Setelah diperoleh kesepuluh area tersebut, dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar masing-masing,
sehingga diperoleh konsentrasi dan standar deviasinya. Besarnya LOD adalah tiga kali dari nilai standar deviasi.
e. Injeksi ekstrak sampel ke kolom HPLC Hertog et al. a, 1992 Ekstrak sampel yang telah disaring dengan syringe filter
0.45µm, diinjeksikan ke kolom HPLC C-18 phase; Develosil ODS-UG-3 yang memiliki dimensi panjang 75 mm dan diameter
dalam 4.6 mm. Fase gerak yang digunakan adalah 25 acetonitril di dalam KH
2
PO
4
0.025 M, dengan laju aliran 0,9 mlmenit.
f. Identifikasi flavonoid pada sampel Hasil dari kromatogram sampel kemudian dibandingkan
dengan kromatogram standar. Penentuan komponen yang terdapat pada sampel dilihat berdasarkan waktu retensi masing-masing standar.
Dari area yang diperoleh, dihitung konsentrasinya dengan menggunakan persamaan garis dari kurva standar campuran yang
sudah diperoleh. Selain itu dilakukan pula perhitungan dengan menggunakan eksternal standar, yaitu dengan membandingkan luas
area komponen pada sampel dengan luas area pada standar campuran. Standar campuran yang digunakan sebagai eksternal standar adalah
standar campuran dengan konsentrasi yang tertinggi.
Gambar 14. Persiapan sampel Sampel
Pencucian
Freeze drying selama 48 jam
Sampel kering beku bubuk
Pembekuan selama 24 jam
Penyimpanan dalam freezer Penghancuran dengan blender kering
Sampel kering beku Penirisan
Gambar 15. Prosedur analisis total fenol 50.0 miligram sampel
kering beku bubuk 2.5 ml
etanol 95
2.5 ml Folin Ciocalteu 50
0.5 ml Na
2
CO
3
5 0.5 ml supernatan
Supernatan Endapan
2.5 ml aquadest 0.5 ml etanol 95
Pelarutan
Pemusingan selama 5 menit dengan kecepatan 4000 rpm
Pencampuran
Pendiaman selama 5 menit
Pencampuran
Penyimpanan dalam ruang gelap selama 1 jam
Pembacaan absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm
Labu takar
100 ml
Gambar 16. Proses pembuatan ekstrak flavonoid dari sayuran indigenous Pelarutan
0.500 atau 1.000 gram sampel kering
beku bubuk
2 gL TBHQ 40 ml MeOH
aq
62.5
Pencampuran 10 ml HCl 6M
Perefluksan selama 1 jam pada suhu 50
°C Pendinginan
Pencampuran sampai volume 100 ml
MeOH
aq
62.5
Penyaringan dengan saringan berdiameter 0.45
μm
Ekstrak sayuran
Gelas piala
400 ml
Gambar 17. Pembuatan larutan standar flavonoid 2.5 ml
standar stock
20 ml MeOH
aq
62.5 2 gL TBHQ
Pelarutan
Pencampuran 5 ml HCl 6M
Pencampuran sampai volume 50 ml
MeOH
aq
62.5
Larutan standar flavonoid
1.5 mg standar flavonoid
Standar stock Pelarutan
3 ml MeOH
aq
62.5
Labu takar
50 ml
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. STANDAR FLAVONOID DAN LIMIT DETEKSI
1. Myricetin
Pada penelitian kali ini, kurva standar myricetin dibuat dengan variasi konsentrasi antara 0.5-25 µgml. Puncak senyawa myricetin
muncul pada kisaran menit ke-3.7 sampai menit ke-3.9. Gambar 18 menunjukkan hasil kromatogram standar myricetin pada berbagai
konsentrasi. Persamaan garis yang diperoleh adalah y = 141.9 x – 44.599 dengan r
2
= 0.9998. Kurva standar senyawa myricetin dapat dilihat pada Gambar 19. Limit deteksi dari myricetin adalah 0.0268 µgml. Untuk lebih
jelas mengenai perhitungan limit deteksi dari myricetin, dapat dilihat pada Tabel 4.
Gambar 18. Kromatogram standar myricetin
