Apigenin adalah senyawa lainnya dari golongan flavone yang akan diidentifikasi pada penelitian ini. Apigenin merupakan aglikon dari apiin,
yang diisolasi dari daun tanaman peterseli dan seledri. Senyawa ini berbentuk padatan dan berwarna kuning, dan sering digunakan untuk pencelupan bulu
domba Anonim, 2006a. Senyawa apigenin memiliki kemampuan antara lain sebagai zat anti peradangan, antibakteri, dan untuk mengatasi permasalahan
lambung Cadenas dan Packer, 2002.
C. IDENTIFIKASI SENYAWA FLAVONOID
High Performance Liquid Chromatography HPLC merupakan alat yang penting dalam kimia analitik. HPLC memiliki kemampuan untuk
memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung jumlah komponen yang terdapat dalam sampel apapun yang dapat dilarutkan dalam air. Dengan
kemampuannya yang seperti ini, maka jumlah suatu komponen yang sangat sedikit pun dalam part per trillion dapat ditentukan secara mudah. HPLC
dapat diaplikasikan untuk sampel apapun, seperti dalam bidang farmasi, pangan, nutraceuticals, kosmetik, lingkungan, forensik, dan industri kimia
Anonim, 2006e. Komponen utama dari sistem HPLC adalah pompa tekanan tetap
dan volume tetap, penginjeksi, kolom eksternal dan internal, detektor, dan rekorder atau sistem data yang terintegrasi Rounds dan Gregor, 2003.
Parameter-parameter yang akan mempengaruhi sistem kerja pada HPLC antara lain adalah diameter dalam dari kolom HPLC, ukuran partikel, ukuran
lubang pada fase diam, dan tekanan pompa Anonim, 2007c. Menurut Rounds dan Gregor, 2003, terdapat lima tipe HPLC yaitu
Normal phase chromatography, reversed phase chromatography, Ion- exchange chromatography, size-exclusion chromatography, dan affinity
chromatography. Pada penelitian ini, tipe HPLC yang digunakan adalah reversed phase chromatography RP-HPLC. Fase diam dari HPLC jenis ini
adalah senyawa nonpolar, sedangkan fase geraknya polar. Karena hal tersebutlah maka komponen yang akan keluar terlebih dahulu adalah
komponen yang polar dibandingkan yang nonpolar.
Lebih dari 70 teknik pemisahan dengan metode HPLC menggunakan tipe reversed phase. Beberapa contoh teknik pemisahan yang
menggunakan metode RP-HPLC adalah analisis protein dari tanaman, protein dari biji-bijian, analisis vitamin larut air dan larut lemak, pemisahan
karbohidrat, dan penentuan unsur-unsur pokok dari minuman ringan. Reversed phase HPLC dengan metode deteksi yang sangat bervariasi, digunakan untuk
menganalisis lemak Rounds dan Gregor, 2003. Antioksidan, seperti butylated hydroxyanisole BHA dan butylated
hydroxytoluene BHT, dapat diekstrak dari bahan pangan kering dan dianalisis dengan menggunakan detektor UV dan fluoresens secara
bersamaan. Bahan pangan basah, pigmen seperti klorofil, karotenoid, dan antosianin, dan komponen fenolik seperti vanili, dapat pula dianalisis
dengan mengunakan metode RP-HPLC Rounds dan Gregor, 2003. Kolom reversed phase chromatography lebih sulit untuk rusak
dibandingkan dengan kolom silika normal. Hal ini dikarenakan kolom RP- HPLC terdiri atas alkil turunan silika dan tidak pernah digunakan dengan
larutan basa karena larutan basa akan menghancurkan ikatan silika. Kolom RP-HPLC dapat digunakan dengan larutan asam tetapi tidak boleh kontak
terlalu lama karena asam dapat menimbulkan korosi pada logam yang ada dalam peralatan HPLC. Kandungan logam pada kolom HPLC harus dijaga
agar tetap rendah supaya dapat memberikan hasil terbaik pada pemisahan komponen. Salah satu cara untuk mengetahui kandungan logam di dalam
kolom HPLC adalah dengan menginjeksikan campuran dari 2,2’- dan 4,4’-bipiridin. Bila terdapat ion logam di permukaan silika, maka senyawa
2,2’-bipiridin akan mengkelat logam tersebut dan peak dari senyawa yang akan diidentifikasi menjadi tidak teratur sehingga dapat memberikan hasil
yang tidak sesuai Anonim, 2007c. Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mendeteksi komponen
fenolik dalam bahan pangan dengan menggunakan metode HPLC. Komponen fenolik merupakan senyawa aromatik, oleh karena itu, senyawa tersebut akan
memberikan penyerapan yang baik pada panjang gelombang sinar UV. Flavonoid, yang merupakan bagian sari senyawa fenolik, memiliki serapan
pada panjang gelombang antara 240 dan 270 nm, dan antara 320 dan 380 nm. Untuk itulah, pada deteksi komponen fenolik, detektor yang digunakan pada
komponen HPLC adalah detektor UV atau UV-Vis Lee, 2000. Fase gerak yang biasa digunakan dalam identifikasi senyawa fenolik
dengan HPLC adalah metanol, acetonitril, dan tetrahidrofuran. Penggunaan tetrahidrofuran sebagai fase gerak dalam sistem HPLC, memberikan hasil
pemisahan yang terbaik; diikuti oleh acetonitril, dan yang terakhir metanol. Namun, pada identifikasi senyawa flavonoid, fase gerak yang biasa digunakan
adalah metanol dan acetonitril. Tetrahidrofuran akan memberikan hasil yang sangat signifikan berbeda bila digunakan untuk mengidentifikasi asam sinamat
dalam jus jeruk Lee, 2000. Analisis flavonoid pada buah berry raspberry merah, blueberry,
cranberry, dan blackberry telah banyak dilakukan Rommel dan Wrolstad, 1993 dan Tandjung et al., 1994 yang dikutip oleh Lee, 2000. Senyawa
flavonol aglikon quercetin, myricetin, dan kaempferol dapat dipisahkan dengan menggunakan fase gerak campuran antara acetonitril dan 1 asam
asetat dalam air. Kolom yang digunakan adalah Partisil 5 ODS-3 column 250 x 4.6-mm ID, dengan laju aliran 1mlmenit. Deteksi flavonol dilakukan pada
panjang gelombang UV 360 nm. Analisis flavonoid pada sayuran seperti yang dikemukakan oleh
Hertog et al. a 1992 banyak diadopsi oleh para peneliti-peneliti lain Lee, 2000. Identifikasi flavonoid pada sayuran dilakukan dengan menggunakan
fase gerak 25 acetonitril dalam buffer fosfat 0.025 M. Laju alirannya adalah 0.9 mlmenit. Sampel yang akan diidentifikasi akan melewati kolom Nova-
Pak C18, yang memiliki dimensi 150 x 3.9-mm ID. Detektor yang digunakan yaitu Linear Model 204 UV-Vis detector Hertog et al. a 1992.
III. BAHAN DAN METODE A.
