22 bagian kristal K
2
SO
4
, satu atau dua butir batu didih serta 20 ml asam sulfat pekat. Destruksi dilakukan sampai diperoleh larutan jernih tidak berwarna atau
berwarna hijau muda minimum 2 jam . Hasil destruksi selanjutnya didinginkan dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 100 ml, dan ditambahkan
akuades dengan hati-hati. Sebanyak 50 ml larutan asam borat 5 dipipet ke dalam gelas Erlenmeyer dan ditambahkan 5 tetes indikator tashiro campuran
larutan yang terdiri dari 100 ml metil merah 0.03 dalam etanol 95 dengan 15 ml metil biru 0.1 dalam etanol 95. Selanjutnya labu dilengkapi dengan
kondensor dan diletakkan sedemikian sehingga ujung kondensor dimana embunan menetes tercelup ke dalam larutan asam borat. Larutan contoh dipipet
10 ml ke dalam labu yang terpasang pada labu destilasi dengan menggunakan corong dan ditambahkan 3 tetes indikator fenolfetalein 1 dalam etanol 95.
Selanjutnya labu tersebut dipanaskan hingga semua gelembung amonia ke luar sampai jumlah destilat ± 150 ml. Setelah selesai rangkaian destilasi dilepaskan
secara hati-hati, dan ujung kondensor dicuci dengan aquadest, kemudian larutan penampung dititrasi dengan larutan standar HCl 0.1 N hingga berubah warna.
Kadar protein dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: 100
1000 25
. 6
14 x
x C
F x
x x
B x
A protein
= Di mana :
A = Volume larutan HCl yang digunakan untuk titrasi ml B = Normalitas larutan HCl yang digunakan untuk titrasi
C = Berat sampel gram F = Faktor pengenceran
d. Pengujian Kadar Lemak Total
Penetapan lemak total dilakukan dengan metode soxhlet menurut SNI 01 – 2354.3-2006 BSN 2006. Prinsip Penetapan lemak total dengan metode tersebut
adalah ekstraksi pelarut semikontinyu, di mana pelarut pertama mengekstraksi sampel selama 5-10 menit kemudian bergerak kembali ke dalam labu ekstraksi.
Sekitar 2 gram sampel ditimbang dalam selubung ekstraksi. Kemudian selubung yang sudah berisi sampel dimasukkan ke dalam soxhlet. Kemudian
soxhlet dan kondensor dipasang pada labu ekstraksi yang telah ditimbang terlebih
23 dahulu. Kemudian ditambahkan kurang lebih 50 ml dietil eter, lalu dipasang pada
pemanas. Laju kecepatan kondensasi diatur sebesar 5 atau 6 tetes perdetik selama 4 jam atau 16 jam pada kecepatan kondensasi 2 atau 3 tetes perdetik. Kemudian
solven dalam labu ekstraksi diuapkan dan labu ekstraksi tersebut beserta ekstrak lemak selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 100
o
C selama 60 menit atau sampai beratnya tetap, lalu dinginkan dalam desikator dan ditimbang.
Kadar lemak dalam sampel dihitung dengan rumus: 100
x sampel
gram ekstraksi
labu dalam
lemak gram
lamak =
e. Pengujian Profil Asam Lemak
Pengujian profil asam lemak dilakukan menurut Kinsella et al. 1978. Untuk mengukur profil asam lemak terlebih dahulu dilakukan ekstraksi minyak
ikan dari daging ikan. Prosedur ekstraksi minyak ikan dilakukan menurut Bligh dan Dyer 1959 sebagai berikut: Sebanyak 30 gram ikan ditimbang,
ditambahkan campuran 60 ml metanol dan 30 ml kloroform dan dihomogenisasi dengan blender selama 2 menit. Kemudian ditambahkan kloroform lagi sebanyak
30 ml, dan diblender kembali selama 30 detik, lalu ditambahkan 30 ml aquades. Kemudian homogenat diaduk dengan batang pengaduk, dan disaring dengan
kertas whatman No.1. Kemudian filtrat dipindahkan ke corong pisah. Fase yang lebih jernih dialirkan ke dalam labu lemak, selanjutnya dievaporasi dengan vakum
rotari evaporator pada suhu 40
o
C sehingga diperoleh minyak ikan. Minyak ikan tersebut kemudian disimpan pada suhu -40
o
C untuk analisis berikutnya. Setelah minyak ikan diperoleh selanjutnya dilakukan derivatisasi asam
lemak untuk membentuk Fatty Acid Methyl Ester FAME dan tahap terakhir pengujian profil asam lemak adalah analisa FAME dengan Gas Chromatography.
Derivatisasi Asam Lemak Kinsella et al. 1978
Prosedur derivatisasi asam lemak adalah sebagai berikut: sebanyak 15 mg ekstrak lipid ditambah 1 mg asam margarat sebagai standar internal, kemudian
disaponifikasi dengan 1 ml KOH 0.5N dalam dry methanol selama 5 menit pada suhu 95
o
C. Kemudian dinetralisasi dengan HCl 0.7N, dan ditambah 3 ml larutan boron trifluorida BF
3
14 dalam metanol. Kemudian campuran tersebut
24 dipanaskan selama 5 menit pada suhu 90
o
C untuk menyempurnakan proses metilasi. FAME yang terbentuk diekstraksi dari campuran tersebut sebanyak tiga
kali dengan heksana sebanyak 15 ml, dan dipekatkan sampai 0.5 ml. Selanjutnya dikuantifikasi dengan Gas Chromatography.
Analisis Asam Lemak secara Gas Chromatography Kinsella et al. 1978
Kandungan dan komposisi FAME dianalisis dengan Gas Chromatography
dengan kondisi sebagai berikut: Kolom
: Kolom DB-Wax Fused Silica panjang 30 meter dan diameter dalam 0.25 m.
Suhu Kolom : Suhu terprogram yaitu 130
o
C suhu awal selama 3 menit, kemudian dinaikkan dengan kecepatan 2.5
o
C menit sampai 240
o
C. Suhu 240
o
C dipertahankan selama 4 menit.
Detektor : FID
Suhu detektor : 260
o
C Suhu injektor
: 250
o
C Gas pembawa : Nitrogen 40 mlmenit
Gas Pembakar : Hidrogen 45 mlmenit dan Udara 240 mlmenit Untuk identifikasi asam lemak dalam sampel dilakukan dengan
mencocokkan waktu retensi peak asam lemak sampel dengan waktu retensi peak standar FAME murni yang terdiri dari : C4:0, C6:0, C8:0, C10:0, C11:0, C12:0,
C13:0, C14:0, C14:1, C15:0, C15:1, C16:0, C16:1, C17:0, C17:1, C18:0, C18:1n9t, C18:1n9c, C18:2n6t, C18:2n6c, 18:3n3, 18:3n6, C20:0, C20:1, C20:2,
C20:3n6, C20:3n3, C20:4n6, C20:5n3, C21:0, C22:0, C22:1n9, C22:2, C22:6n3, C23:0, C24:0 dan C24:1.
Untuk menghitung jumlah asam lemak jenuh maupun tidak jenuh dilakukan dengan tiga tahap yaitu:
• Menghitung retension Factor RF dari masing-masing asam lemak dengan
rumus: SE
dalam SI
i Konsentras
SE dalam
A AL
i Konsentras
x SE
dalam A
AL Area
SE dalam
SI Area
RF
A AL
=
25 •
Membandingkan waktu retensi rt asam lemak yang terdapat dalam sampel dengan waktu retensi asam lemak dalam standar eksternal.
• Menghitung asam lemak yang teridentifikasi dalam sampel mg asam lemak A
per gram sampel, dengan rumus sbb: sampel
gram SI
mg x
xRF SI
Area A
AL Area
sampel g
A AL
mg
A AL
= Di mana :
RF
AL A
= Retension factor asam lemak A SI
= Standar internal SE
= Standar eksternal
3.4.2 Pengujian Oksidasi Lemak a.
Pengujian Angka TBARS
Pengujian angka TBARS dilakukan menurut Ramanathan 1992. Prinsip pengukuran angka TBARS adalah pengukuran terhadap produk sekunder dari
oksidasi lipid yaitu malonaldehida MDA, di mana reaksi TBA dengan malonaldehida menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada panjang
gelombang 532 nm, sehingga bisa diukur secara spektrofotometri. Prosedur pengujian angka TBARS adalah sebagai berikut: sebanyak 10
gram sampel ikan yang telah mendapat perlakuan dihomogenisasi dengan 25 ml air destilata menggunakan homogenizer selama 30 detik pada kecepatan 10.000
rpm. Kemudian ditambahkan 25 ml TCA 10 ke dalam homogenat dan dicampur dengan vortex, lalu disaring. Sebanyak 4 ml filtrat dipipet ke dalam
tabung reaksi, ditambah 1ml TBA 0.06 M, kemudian dipanaskan dalam waterbath yang mendidih selama 10 menit untuk pembentukan warna dan didinginkan.
Kemudian absorban diukur dengan menggunakan spektrofotometer double-beam pada panjang gelombang 532 nm.
Adanya oksidasi lipid dinyatakan sebagai Angka TBARS mg MDA kg ikan yang dihitung menggunakan persamaan regresi kurva standar dengan TEP
sebagai standar.
26
b. Pengujian Angka Anisidin
Pengukuran angka anisidin dilakukan menurut AOCS method Cd 18-90 AOCS, 1997. Prinsip pengukuran metode ini adalah angka anisidin menentukan
jumlah aldehida terutama 2-alkenals dan 2,4-dienals dalam lemak. Aldehida bereaksi dengan p-anisidin membentuk kromogen yang diukur secara
spektrofotometri. Prosedur pengukuran angka anisidin adalah sebagai berikut: sebanyak 0.5 –
4 g minyak ikan ditambah 25 ml isooktan dan larutan ekstrak tersebut diukur absorbannya Ab pada 350 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Kemudian
sebanyak 5 ml ekstrak minyak dipipet ke dalam tabung, kemudian ditambahkan 1 ml p-anisidin 0.25 dalam asam asetat glasial. Tabung ditutup, dikocok dan
dibiarkan pada tempat gelap selama 10 menit. Absorban larutan tersebut As diukur pada panjang gelombang 350 nm.
Angka anisidin dihitung dengan rumus: sampel
gram Ab
As x
anisidin Angka
2 .
1 25
− =
di mana : As = absorban setelah reaksi dengan p-anisidin
Ab = absorban sebelum reaksi dengan p-anisidin
c. Pengujian Produk Berfluoresen
