commit to user 22
kemudian difoto dengan menggunakan kamera digital. Apabila terdeteksi adanya pita berarti ekstraksi DNA dari sampel berhasil.
Uji kuantitas DNA dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm. Menurut formula yang digunakan dalam
perhitungan menggunakan alat RNADNA kalkulator menyatakan bahwa absorbansi A
260
1,0 sesuai untuk 50 µgmL DNA murni untai ganda, maka kadar DNA sampel dapat dicari melalui perhitungan
berikut : XµgmL =
Keterangan : X : kadar DNA yang dicari
A260 : absorbansi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8
– 2,0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi protein
didalam larutan Ratnayani K et al, 2009 .
4. Amplifikasi DNA mikrosatelit dengan Polymerase Chain Reaction PCR
DNA yang diperoleh langsung digunakan untuk reaksi PCR yang dilakukan dalam mesin PCR Applied Biosystem. Fragmen DNA
diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer berturut-turut ETH225, TGLA227, INRA005, BM1824 dan MM12.
Berikut sekuen nukleotida dari masing-masing primer yang akan digunakan dalam analisis mikrosatelit :
commit to user 23
Tabel 1. Sekuen nukleotida primer mikrosatelit
Marker Sekuen primer
Letak
kromosom
Ukuran alel
basepair Tm
◦C referensi
ETH225 F:5’GATCACCTTGCCACTATTTCCT3’
R:3’ACATGACAGCCAGCTGCTACT5’ 9
141-159 60
Steffen et al.1993
TGLA227 F:5’CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT3’
R:3’ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA5’ 21
64 –115
48-60 Georges
and Massey 1992
INRA005 F:5’CAATCTGCATGAAGTATAAATAT3’
R:3’CTTCAGGCATACCCTACACC5’ 12
240-246 58
Vaiman et
al. 1992
BM1824 F:5’GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC3’
R:3’CATTCTCCAACTGCTTCCTTG5’ 1
180-192 58
Bishop et al. 1994
MM12 F:5’CAAGACAGGTGTTTCAATCT3’
R:3’ATCGACTCTGGGGATGATGT5’ 9
107 –133
50 Mommens
and Coppieters 1994
Keterangan: Tm : melting temperatur
: batas bawah Tm F : Forward primer
R : Reserve primer
Semua reaksi amplifikasi dilakukan dalam volume 15 l campuran
reaksi yang terdiri dari: 3 l DNA template, 0,5 l dari masing-masing oligonukleotida primer primer forward dan reserve
, 6 l Go Taq Green dan 5 l nuclease free water dalam 0,6 ml tabung effendorf. Kondisi reaksi
amplifikasi PCR amplifikasi DNA sebagai berikut: satu tahap reaksi denaturasi awal pada suhu 95
C selama 5 menit, diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang masing-masing siklus terdiri dari: denaturasi pada suhu 95
C selama 60 detik, annealing dengan suhu berdasarkan Tm primer selama 60
detik, dan exstention pada suhu 72 C selama 1 menit; diikuti dengan satu
tahap polimerasi final pada suhu 72 C selama 5 menit.
commit to user 24
5. Analisis produk PCR dan deteksi alel DNA
Hasil amplifikasi dengan PCR difraksinasi dengan elektroforesis gel poliakrilamid 12 yang dilanjutkan dengan pewarnaan dengan ethidium
bromida. Berdasarkan Qiagen Supplemantary Ptotocol Gel Poliakrilamid 12 dibuat dengan cara mencampurkan bahan-bahan berikut : 7,2 gram urea,
buffer TBE 10X 1,5 ml dan 5,4 ml 30 akrilamid : bis akrilamid 19 : 1 pada erlenmeyer, selanjutnya ditambahkan dengan aquabides sampai 15 ml.
Selanjutnya larutan dipanaskan dalam microwave selama 9 detik dengan power level tinggi sampai seluruh larutan terlarut dengan sempurna. Setelah
larutan tercampur sempurna kemudian ditambahkan 75 µ l 10 ammonium persulfat APS kemudian ditambahkan dengan segera 7,5 µ l
N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine TEMED dan tetap diaduk perlahan. Setelah
penambahan APS dan TEMED, larutan poliakrilamid 12 segera dituangkan kedalam cetakan agar larutan tidak mengalami polimerisasi. Untuk resep
dengan volume 15 ml digunakan cetakan dengan ukuran 7x10 cm. Tahap selanjutnya adalah persiapan sampel. Denaturasi sampel
dilakukan pada suhu 95 C selama 2 menit dan dilanjutkan dengan
memasukkan dalam pecahan es. Selanjutnya gel dipasang pada alat dan dilanjutkan dengan memasukkan sampel hasil PCR dan marker ke dalam
sumuran. Harus dipastikan bahwa dalam tahapan ini tidak lebih dari 20 menit supaya sampel tetap berada pada keadaan dingin. Selanjutnya power supply
dinyalakan dan diatur pada 120 volt dan 400 miliamper. Running dilakukan pada dyes pewarna mencapai bagian bawah gel. Setelah pewarnaan kita-kira
commit to user 25
mencapai daerah munculnya pita maka running dapat dihentikan dan tangki elektroforesis dapat dikosongkan dari buffer. Selanjutnya pindahkan gel
perlahan-lahan dari plate dan siap dilakukan pewarnaan dengan ethidium bromide. Gel poliakrilamid direndam dalam ethidium bromida selama 15
menit. Ethidium bromida dibuat dengan mencampurkan 1 µl EtBr yang dilarutkan dengan 100 ml aquades.
Elektroforesis gel poliakrilamid mampu memisahkan DNA lebih sempurna dengan jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit Allen et al.,
1984. Hasil pemisahan fragmen DNA dideteksi dengan geldoc. Pita hasil amplifikasi kemudian dicatat dan diberi nilai. Setiap pita DNA yang muncul
dibandingkan ke marker untuk mengetahui panjangnya. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel.
D. Analisis Data
