commit to user 17
BAB III METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat Universitas Sebelas Maret Surakarta dan Laboratorium Biologi MIPA Universitas Sebelas Maret Surakarta.
Waktu penelitian dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai Januari 2011.
B. Bahan dan Alat
1. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah sapi Bali dari Sumbawa dan sapi Aceh. Pengambilan sampel darah sapi Bali dari
Sumbawa di Kecamatan Marongge, Kabupaten Sumbawa, sedangkan pengambilan sampel darah sapi Aceh di BPTU Balai Pembibitan Ternak
Unggul Sapi Aceh Indrapuri – Nanggroe Aceh Darussalam. Masing-masing
sampel darah sebanyak 20 individu yang disimpan dalam venoject berisi EDTA.
Bahan kimia yang digunakan untuk penelitian dibagi dalam beberapa bagian sesuai tahapan penelitian, yaitu:
Ekstraksi DNA yaitu: Wizard Genomic DNA Purification Kit dari Promega
cell lysis solution, nuclei lysis solution, protein presipitation solution, DNA rehydration, isopropanol, etanol 70, sampel darah Sapi Bali dari
Sumbawa dan Sapi Aceh.
commit to user 18
Uji Kuantitas DNA yaitu: DNA hasil lisis dan aquades sebagai blangko.
Uji kualitas DNA yaitu: DNA hasil lisis, ultra pure DNA Grade agarose
1 dari Bio Rad, 1X TAE buffer Tris Acetic Acid, blue loading dye dan ethidium bromida.
PCR MIX yaitu: Go Tag Green master mix Promega, USA, Nuclease
Free Water dari Ambion, 5 primer mikrosatelit BM1824, ETH225, INRA005, MM12, dan TGLA227 dari SIGMA, DNA hasil lisis
diencerkan 10X.
Analisis Mikrosatelit yaitu: 10X TBE buffer Tris Borate, 10 APS Ammonium Peroxodisulfate Solution, N,N,N,N Tetramethylethylene -
diamine TEMED, aquades steril, Blue loading dye, acrylamid:bis 19:1 30, Urea, 100 - 1500 base pare DNA Moleculare Weight Marker, buffer
TBE 1X dan ethidium bromida EtBr.
2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sentrifuge Hettich Mikro 22R Jerman, satu set micropipet ukuran 10
, 200 , 1.000 , satu set tips 10
, 200 , 1.000 , tabung mikro 1,5 ml Axygen, tabung mikro 0,6 ml, satu set alat elektroforesis horisontal dan power supply Bio
Rad, satu set alat elektroforesis vertikal dan power supply Bio Rad, microwave, inkubator, waterbath Julabo, Gene Amplification PCR system
9700 Thermo Cycler Applied Biosystem, Autoclave Ogawa Saiki Co., Erlenmeyer, gelas ukur, tabung venoject, vortex mixer Gemmy Industrial
Corp. Taiwan, lemari pendingin suhu 4 C, freezer suhu -20
C, timbangan
commit to user 19
elektrik Denver Instrumen, UV transluminator , kamera digital dan geldoc Vilber Lourmat.
C. Cara Kerja
1. Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah diambil sebanyak 3 ml dari masing – masing individu
20 individu sapi Bali dari Sumbawa dan 20 individu sapi Aceh secara venopuncture menggunakan venoject dengan ukuran 10 ml yang berisi EDTA
untuk mencegah terjadinya pembekuan darah . Darah disimpan pada suhu - 20
C untuk digunakan langsung dalam penelitian ini dan sebagai referensi di kemudian hari.
2. Ekstraksi DNA
DNA diekstrak dari total darah dengan menggunakan teknik Wizard Genomic Purification System tahun 2010 Promega, Madison USA. DNA
diekstrak langsung dari total darah. Sebanyak 300 mikroliter total darah
dimasukkan kedalam 1,5 tabung mikrosentrifuse yang steril dan berisi 450
larutan pelisis sel cell lysis solution, dicampur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk melisis sel darah merah yang mungkin masih
tercampur. Sel darah putih kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 14.000g gravitasi selama 20 detik untuk memperoleh endapan sel darah putih.
Supernatan bening bagian atas yang terbentuk diambil dan dibuang, kemudian tabung mikrosentrifuse yang berisi endapan sel darah putih divortek
selama 3 –5 menit agar sel–sel darah putih memisah secara sempurna.
Sebanyak 150 nuclei lysis solution ditambahkan kedalam tabung
commit to user 20
mikrosentrifuse yang berisi suspensi tersebut, kemudian dicampur dengan menggunakan pipet sebanyak 5
– 6 kali untuk melisis sel–sel darah putih. Kemudian di inkubasi selama 15 menit pada suhu 37
C. Setelah itu sampel didinginkan pada suhu kamar selama 5 menit, yang dilanjutkan dengan
penambahan 60 protein precipitation solution untuk membentuk precipitat
protein kedalam lisat, kemudian dihomogenkan dengan vortek selama 10 – 20
detik dan disentrifugasi pada 14.000g selama 3 menit untuk membentuk endapan protein.
Supernatan diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikrosentrifuse steril yang baru yang sebelumnya telah diisi dengan 150
isopropanol. Campuran yang diperoleh dicampur dengan sempurna dengan membolak
– balikkan tabung mikrosentrifuse sampai terbentuknya materi seperti benang
berwarna putih. DNA kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14.000g selama 1 menit pada suhu kamar. Supernatan dibuang kemudian ditambah 300
ethanol 70 dan tabung yang berisi larutan DNA dan ethanol ini dibolak –
balik untuk mencuci endapan DNA dan juga sisi –sisi tabung mikrosentrifuse.
DNA kemudian diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14.000g selama 1 menit. Ethanol diambil dengan hati-hati, kemudian tabung
mikrosentrifuse dibalik dan dibiarkan dibuka untuk mengeringkan DNA. Setelah kering, 100
larutan DNA rehydration solution ditambahkan kedalam tabung dan DNA direhidrasi dengan cara inkubasi pada waterbath
pada suhu 65 C selama 1 jam. DNA yang diperoleh kemudian disimpan pada
commit to user 21
suhu 2- 8 C sampai penggunaan berikutnya Certificate of Analysis; Wizard
TM
Genomic DNA Purification System, Promega Corporation, 2010.
3. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
DNA yang diperoleh dari hasil ekstraksi di uji kualitas dan kuantitasnya. Uji kualitas DNA dilakukan dengan elektroforesis horisontal
menggunakan gel agarose 1 dalam buffer TAE Tris-EDTA. Uji dilakukan dengan mencampur 5
DNA yang akan dicek dan 2 loading dye. 1 gel agarose dibuat dengan melarutkan 0,48 mg serbuk agarose dalam 48 ml 1 x
buffer TAE Tris-EDTA . Selanjutnya campuran buffer tersebut dipanaskan dalam microwave pada suhu sedang medium selama 2 menit. Setelah itu
Erlenmeyer dikeluarkan dari microwave dan ditunggu sampai suhu turun menjadi suhu kamar hangat, selanjutnya larutan gel agarose dituangkan ke
dalam cetakan yang sebelumnya telah dipasangi sisir dan ditunggu hingga gel mengeras. Setelah gel mengeras sisir diangkat dengan hati-hati untuk
menghindari rusaknya gel agarose, maka akan terbentuk sumuran – sumuran
kecil. Selanjutnya gel dimasukkan ke dalam tangki yang berisi 1X buffer TAE Tris-EDTA sampai terendam, kemudian sampel DNA dan Loading dye di
masukkan ke dalam sumuran-sumuran kecil pada gel agarose. Proses elektroforesis berlangsung selama 30 menit pada 85 volt, setelah proses selesai
gel agarose direndam dalam ethidium bromida. Ethidium bromida dibuat dengan mencampurkan 2 tetes EtBr yang dilarutkan dengan 100 ml aquades.
Hasil pemisahan fragmen DNA dideteksi dengan UV transluminator,
commit to user 22
kemudian difoto dengan menggunakan kamera digital. Apabila terdeteksi adanya pita berarti ekstraksi DNA dari sampel berhasil.
Uji kuantitas DNA dilakukan dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm. Menurut formula yang digunakan dalam
perhitungan menggunakan alat RNADNA kalkulator menyatakan bahwa absorbansi A
260
1,0 sesuai untuk 50 µgmL DNA murni untai ganda, maka kadar DNA sampel dapat dicari melalui perhitungan
berikut : XµgmL =
Keterangan : X : kadar DNA yang dicari
A260 : absorbansi sampel DNA pada panjang gelombang 260 nm DNA dikatakan murni jika rasio kedua nilai tersebut berkisar antara 1,8
– 2,0. Jika nilai rasio lebih kecil dari 1,8 maka masih ada kontaminasi protein
didalam larutan Ratnayani K et al, 2009 .
4. Amplifikasi DNA mikrosatelit dengan Polymerase Chain Reaction PCR
DNA yang diperoleh langsung digunakan untuk reaksi PCR yang dilakukan dalam mesin PCR Applied Biosystem. Fragmen DNA
diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer berturut-turut ETH225, TGLA227, INRA005, BM1824 dan MM12.
Berikut sekuen nukleotida dari masing-masing primer yang akan digunakan dalam analisis mikrosatelit :
commit to user 23
Tabel 1. Sekuen nukleotida primer mikrosatelit
Marker Sekuen primer
Letak
kromosom
Ukuran alel
basepair Tm
◦C referensi
ETH225 F:5’GATCACCTTGCCACTATTTCCT3’
R:3’ACATGACAGCCAGCTGCTACT5’ 9
141-159 60
Steffen et al.1993
TGLA227 F:5’CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT3’
R:3’ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA5’ 21
64 –115
48-60 Georges
and Massey 1992
INRA005 F:5’CAATCTGCATGAAGTATAAATAT3’
R:3’CTTCAGGCATACCCTACACC5’ 12
240-246 58
Vaiman et
al. 1992
BM1824 F:5’GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC3’
R:3’CATTCTCCAACTGCTTCCTTG5’ 1
180-192 58
Bishop et al. 1994
MM12 F:5’CAAGACAGGTGTTTCAATCT3’
R:3’ATCGACTCTGGGGATGATGT5’ 9
107 –133
50 Mommens
and Coppieters 1994
Keterangan: Tm : melting temperatur
: batas bawah Tm F : Forward primer
R : Reserve primer
Semua reaksi amplifikasi dilakukan dalam volume 15 l campuran
reaksi yang terdiri dari: 3 l DNA template, 0,5 l dari masing-masing oligonukleotida primer primer forward dan reserve
, 6 l Go Taq Green dan 5 l nuclease free water dalam 0,6 ml tabung effendorf. Kondisi reaksi
amplifikasi PCR amplifikasi DNA sebagai berikut: satu tahap reaksi denaturasi awal pada suhu 95
C selama 5 menit, diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang masing-masing siklus terdiri dari: denaturasi pada suhu 95
C selama 60 detik, annealing dengan suhu berdasarkan Tm primer selama 60
detik, dan exstention pada suhu 72 C selama 1 menit; diikuti dengan satu
tahap polimerasi final pada suhu 72 C selama 5 menit.
commit to user 24
5. Analisis produk PCR dan deteksi alel DNA
Hasil amplifikasi dengan PCR difraksinasi dengan elektroforesis gel poliakrilamid 12 yang dilanjutkan dengan pewarnaan dengan ethidium
bromida. Berdasarkan Qiagen Supplemantary Ptotocol Gel Poliakrilamid 12 dibuat dengan cara mencampurkan bahan-bahan berikut : 7,2 gram urea,
buffer TBE 10X 1,5 ml dan 5,4 ml 30 akrilamid : bis akrilamid 19 : 1 pada erlenmeyer, selanjutnya ditambahkan dengan aquabides sampai 15 ml.
Selanjutnya larutan dipanaskan dalam microwave selama 9 detik dengan power level tinggi sampai seluruh larutan terlarut dengan sempurna. Setelah
larutan tercampur sempurna kemudian ditambahkan 75 µ l 10 ammonium persulfat APS kemudian ditambahkan dengan segera 7,5 µ l
N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine TEMED dan tetap diaduk perlahan. Setelah
penambahan APS dan TEMED, larutan poliakrilamid 12 segera dituangkan kedalam cetakan agar larutan tidak mengalami polimerisasi. Untuk resep
dengan volume 15 ml digunakan cetakan dengan ukuran 7x10 cm. Tahap selanjutnya adalah persiapan sampel. Denaturasi sampel
dilakukan pada suhu 95 C selama 2 menit dan dilanjutkan dengan
memasukkan dalam pecahan es. Selanjutnya gel dipasang pada alat dan dilanjutkan dengan memasukkan sampel hasil PCR dan marker ke dalam
sumuran. Harus dipastikan bahwa dalam tahapan ini tidak lebih dari 20 menit supaya sampel tetap berada pada keadaan dingin. Selanjutnya power supply
dinyalakan dan diatur pada 120 volt dan 400 miliamper. Running dilakukan pada dyes pewarna mencapai bagian bawah gel. Setelah pewarnaan kita-kira
commit to user 25
mencapai daerah munculnya pita maka running dapat dihentikan dan tangki elektroforesis dapat dikosongkan dari buffer. Selanjutnya pindahkan gel
perlahan-lahan dari plate dan siap dilakukan pewarnaan dengan ethidium bromide. Gel poliakrilamid direndam dalam ethidium bromida selama 15
menit. Ethidium bromida dibuat dengan mencampurkan 1 µl EtBr yang dilarutkan dengan 100 ml aquades.
Elektroforesis gel poliakrilamid mampu memisahkan DNA lebih sempurna dengan jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit Allen et al.,
1984. Hasil pemisahan fragmen DNA dideteksi dengan geldoc. Pita hasil amplifikasi kemudian dicatat dan diberi nilai. Setiap pita DNA yang muncul
dibandingkan ke marker untuk mengetahui panjangnya. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel.
D. Analisis Data
Analisis data molekuler dilakukan berdasarkan hasil skoring pita DNA yang muncul pada plate. Skoring dilakukan dengan cara: pita yang paling bawah
diberi sandi A dan selanjutnya B, C, dan seterusnya sampai pita paling atas. Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA yang
ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran marker yang sama dan dihitung frekuansi alelnya. Frekuensi alel dihitung berdasarkan
rumus Nei 1987 :
Dimana : Xi = frekuensi alel ke-i nij = jumlah individu yang bergenotipe ii
Xi = 2nij + Σnij2n
commit to user 26
n
PIC = 1 - ∑ Pij
2 j=1
nii = jumlah individu yang bergenotipe ij n = jumlah sampel
Derajat heterozigositas ĥ dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA dengan rumus Nei 1987 :
Keterangan : Xi = frekuensi alel
ĥ = nilai heterozigositas lokus Tingkat polimorfisme PIC = Polimorphism Information Content dari
primer yang digunakan dihitung untuk masing-masing marka SSR Botstein et al, 1980 dengan formula:
dimana ij merupakan frekuensi alel i dan j. Untuk jumlah alel, frekuensi alel, Effective number of alleles, derajat
homozigositas, dan derajat heterozigositas antara sapi Bali - Sumbawa dan sapi Aceh dapat dianalisis dengan menggunakan program POPGENE version 1.31 Yeh
dan Yang, 1999.
ĥ = 2n 1 - ΣXi22n – 1
commit to user 27
Skema cara kerja dalam penelitian ini tergambar dari bagan di bawah ini :
Gambar 5: Bagan alir kerangka kerja. Skoring Pita DNA
Nei, 1987 Deteksi alel
Gel Doc Uji Kualitas DNA
Uji Kuantitas DNA Spectrofotometri
Ekstraksi DNA Wizard Genomic Purification Kit, Promega, USA
Cek DNA Elektroforesis Gel
Agarose 1
Amplifikasi DNA Mikrosatelit dengan PCR
Analisis Produk PCR Elektroforesis Gel Polyacrylamid 12
Analisis Data Pengambilan Sampel
Teknik Venopuncture
commit to user 28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Diversitas Genetik Intra Spesies
Polimorfisme dari kedua genom spesies sapi Bali dari Sumbawa dan sapi Aceh ditetapkan dari hasil amplifikasi DNA dengan primer pengapit mikrosatelit
yang diseparasi dengan elektroforesis gel poliakrilamid dan dilanjutkan dengan teknik pewarnaan ethidium bromide. Elektroforesis gel poliakrilamid mampu
memisahkan DNA lebih sempurna dengan jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit
Allen et al., 1984. Adapun untuk menentukan
jumlah alel dilakukan sesuai petunjuk Leung et al 1993 dengan asumsi bahwa semua pita DNA dengan
laju migrasi yang sama, diasumsikan sebagai lokus yang homolog. Pada studi ini, dilakukan terhadap dua populasi sapi Bali dari Sumbawa dan sapi Aceh
berdasarkan 5 lokus mikrosatelit TGLA227, ETH225, BM1824, INRA005 dan MM12. Semua lokus mikrosatelit yang dipergunakan berhasil teramplifikasi.
Dalam penentuan jenis alel, meskipun setiap lokus menunjukkan jenis alel yang sama misal alel A pada mikrosatelit ETH225 dengan INRA 005, alel tersebut
sebenarnya berbeda karena masing-masing lokus mikrosatelit mencirikan genotip berbeda. Jadi, dalam hal ini alel A pada mikrosatelit ETH225 berbeda dengan alel
A pada mikrosatelit INRA005 demikian seterusnya. Akan tetapi, untuk antar spesies maka ketentuan alel berlaku sama, artinya alel A dengan ukuran tertentu
dari mikrosatelit ETH225 yang terdapat pada spesies sapi Bali dari Sumbawa sama dengan alel mikrosatelit ETH225 pada spesies sapi Aceh. Pada gambar 1