commit to user 19
elektrik Denver Instrumen, UV transluminator , kamera digital dan geldoc Vilber Lourmat.
C. Cara Kerja
1. Pengambilan Sampel Darah
Sampel darah diambil sebanyak 3 ml dari masing – masing individu
20 individu sapi Bali dari Sumbawa dan 20 individu sapi Aceh secara venopuncture menggunakan venoject dengan ukuran 10 ml yang berisi EDTA
untuk mencegah terjadinya pembekuan darah . Darah disimpan pada suhu - 20
C untuk digunakan langsung dalam penelitian ini dan sebagai referensi di kemudian hari.
2. Ekstraksi DNA
DNA diekstrak dari total darah dengan menggunakan teknik Wizard Genomic Purification System tahun 2010 Promega, Madison USA. DNA
diekstrak langsung dari total darah. Sebanyak 300 mikroliter total darah
dimasukkan kedalam 1,5 tabung mikrosentrifuse yang steril dan berisi 450
larutan pelisis sel cell lysis solution, dicampur dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit untuk melisis sel darah merah yang mungkin masih
tercampur. Sel darah putih kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 14.000g gravitasi selama 20 detik untuk memperoleh endapan sel darah putih.
Supernatan bening bagian atas yang terbentuk diambil dan dibuang, kemudian tabung mikrosentrifuse yang berisi endapan sel darah putih divortek
selama 3 –5 menit agar sel–sel darah putih memisah secara sempurna.
Sebanyak 150 nuclei lysis solution ditambahkan kedalam tabung
commit to user 20
mikrosentrifuse yang berisi suspensi tersebut, kemudian dicampur dengan menggunakan pipet sebanyak 5
– 6 kali untuk melisis sel–sel darah putih. Kemudian di inkubasi selama 15 menit pada suhu 37
C. Setelah itu sampel didinginkan pada suhu kamar selama 5 menit, yang dilanjutkan dengan
penambahan 60 protein precipitation solution untuk membentuk precipitat
protein kedalam lisat, kemudian dihomogenkan dengan vortek selama 10 – 20
detik dan disentrifugasi pada 14.000g selama 3 menit untuk membentuk endapan protein.
Supernatan diambil dan dipindahkan kedalam tabung mikrosentrifuse steril yang baru yang sebelumnya telah diisi dengan 150
isopropanol. Campuran yang diperoleh dicampur dengan sempurna dengan membolak
– balikkan tabung mikrosentrifuse sampai terbentuknya materi seperti benang
berwarna putih. DNA kemudian disentrifugasi pada kecepatan 14.000g selama 1 menit pada suhu kamar. Supernatan dibuang kemudian ditambah 300
ethanol 70 dan tabung yang berisi larutan DNA dan ethanol ini dibolak –
balik untuk mencuci endapan DNA dan juga sisi –sisi tabung mikrosentrifuse.
DNA kemudian diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 14.000g selama 1 menit. Ethanol diambil dengan hati-hati, kemudian tabung
mikrosentrifuse dibalik dan dibiarkan dibuka untuk mengeringkan DNA. Setelah kering, 100
larutan DNA rehydration solution ditambahkan kedalam tabung dan DNA direhidrasi dengan cara inkubasi pada waterbath
pada suhu 65 C selama 1 jam. DNA yang diperoleh kemudian disimpan pada
commit to user 21
suhu 2- 8 C sampai penggunaan berikutnya Certificate of Analysis; Wizard
TM
Genomic DNA Purification System, Promega Corporation, 2010.
3. Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Kategori