commit to user 10
berbeda Muladno 2006. Noor 2008 mengatakan adanya kemampuan adaptasi hewan disebabkan hewan memiliki kemampuan menghasilkan lebih
dari satu alternatif bentuk morfologi, status fisiologi, dan tingkah laku sebagai reaksi terhadap perubahan lingkungan pengaturan ekspresi gen.
Perkembangan sejumlah penanda molekuler dewasa ini telah memungkinkan untuk melakukan identifikasi terhadap perubahan-perubahan
genetik yang terjadi dalam suatu persilangan serta hubungannya dengan perubahan sifat kuantitatif dan sifat kualitatif ternak. Selain itu, penanda
molekuler juga dapat digunakan untuk membedakan antara suatu ras ternak dengan lainya terutama dalam kaitannya dengan upaya pelestarian dan
menjaga kemurnian dari ras tersebut Maskur et al., 2007.
4. Polymerase Chain Reaction PCR
Polymerase Chain Reaction PCR adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu
dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. Metode PCR tersebut sangat sensitif. Sensitivitas tersebut
menjadikan PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal
dari sekelompok sekuan genom Mullis dan Faloona, 1989. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan dengan menggunakan
komponen dalam jumlah sangat sedikit Yuwono T, 2006. Empat komponen utama pada proses PCR adalah 1 DNA cetakan,
yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, 2 oligonukleotida primer
commit to user 11
yaitu sepasang DNA utas tunggal atau sekuen oligonukleotida pendek 15 – 25
basa nukleotida yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA, 3 deoksiribonukleotida trifosfat dNTP, terdiri atas dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
dan 4 enzim DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah buffer.
Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang
diinginkan Yepyhardi, 2009. Primer – primer yang digunakan primer sense
dan primer antisense sebaiknya mempunyai nilai Tm melting temperatur yang serupa. Tm adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA
mengalami denaturasi. Nilai Tm oligonukleotida dapat dihitung dengan menggunakan rumus Tm = 2
C x A+T + 4 C x G+C Yuwono, 2006.
Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template sehingga rantai DNA yang berantai ganda double
stranded akan terpisah menjadi rantai tunggal single stranded. Denaturasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas 95
C selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55
C sehingga primer akan menempel annealing pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer
akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Amplifikasi akan lebih efisien jika
dilakukan pada suhu yang lebih rendah 37 C, tetapi biasanya akan terjadi
mispriming yaitu penempelan primer pada tempat yang salah. Pada suhu yang lebih tinggi 55
C, spesifikasi reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi
commit to user 12
secara keseluruhan efisiensinya akan menurun. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang
mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5’-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada
ujung 3’-OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1
–2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi 72
C selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan proses polimerasi
rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan
hidrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru
hasil polimerasi selanjutnya akan di denaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95
C. Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.
Gambar 3. Reaksi amplifikasi DNA dengan teknik PCR Vierstraete, 1999
commit to user 13
Reaksi – reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi
sampai 25 – 30 siklus sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul –
molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan.
Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada konsentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling sedikit, diperlukan 25 siklus untuk
melipatgandakan satu kopi sekuen DNA target di dalam DNA genom mamalia agar hasilnya dapat di lihat secara langsung, misalnya dengan elektroforesis
gel agarose Sambrook et al., 1989.
5. DNA Mikrosatelit
