Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch .1 Pemilihan

37 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch 4.1.1 Pemilihan data sets Data sets yang digunakan adalah senyawa turunan asam sinamat yang memiliki kemiripan dengan senyawa amidasi EPMS dan mempunyai aktivitasi anti-tuberkulosis. Data senyawa turunan sinamat yang digunakan adalah hasil percobaan secara in-vitro yang dilakukan oleh Guzman et al, 2014 terhadap penghambatan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H 37 Rv atau konsentrasi hambat minimum MIC. Data senyawa yang digunakan adalah sebanyak 14, kemudian dibagi menjadi 2 bagian, yaitu 9 senyawa sebagai training sets dan 5 senyawa sebagai test sets. Tabel 4.1 Data sets yang digunakan No. Nama Senyawa dan Struktur Kode Senyawa MIC μM 1 ethyl p-methoxycinnamate S1 485 2 Cinamic acid S2 270 3 3,4-methylenedioxycinnamic acid S3 312 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4 3-Coumaric acid S4 366 5 2-O-prenylcoumaric acid S6 258 6 4-O-prenylcoumaric acid S7 86.1 7 4-O-geranylcoumaric acid S8 66.8 8 Methyl 3-O-Prenylcoumarate S9 172 9 Methyl 4-O-Prenylcoumarate S10 81.2 10 Methyl 2-Coumarate S12 112 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 Caffeic aldehyde S13 154 12 2-Coumaric acid S14 122 13 Methyl 4-Coumarate S15 224 14 3-O-prenylcoumaric acid S16 127 Catatan: Untuk mempermudahkan input data, nama senyawa selanjutnya akan digantikan oleh kode senyawa Tabel 4.2 Data Training sets Tabel 4.3 Data test sets No. Kode Senyawa MIC No. Kode Senyawa MIC 1 S1 485 1 S4 366 2 S2 270 2 S3 312 3 S6 258 3 S16 172 4 S15 224 4 S14 122 5 S9 172 5 S7 86.1 6 S13 154 7 S12 112 8 S10 81.2 9 S8 66.8 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.1.2 Pemilihan deskriptor Training sets

Deskriptor yang digunakan merupakan hasil dari perhitungan logika matematika yang mengubah informasi yang dikodekan dalam suatu molekul kemudian direpresentasikan kedalam angka-angka yang berguna bagi penelitian berikutnya, baik sebagai pengetahuan tentang molekul tersebut maupun sebagai model untuk mempresiksi molekul lain Todeschini, 2009 . Sehingga hasil dari deskriptor tersebut dapat mewakili parameter hidrofobik, elektronik, dan sterik pada HKSA model Hansch. Hal ini dikarenakan proses distribusi, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh sifat kelarutan obat dalam lemakair, suasana pH dan derajat ionisasi pKa sehingga dalam HKSA, parameter yang sering digunakan adalah parameter hidrofobik dan elektronik.Sedangkan untuk proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia, sehingga dalam HKSA, ketiga parameter tersebut ikut dilibatkan, terutama parameter elektronik dan sterik Siswandono, 2008. Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter hidrofobik adalah nilai Log D dengan menggunakan program Marvin sketch, Struktur training sets yang telah dibuat dalam aplikasi Marvin sketch kemudian pilih clean 3D, setelah itu pilih tools  partitioning  logD, untuk mendapatkan nilai logD. Untuk deskriptor elektronik yang digunakan adalah nilai energi HOMO Highest Occupied Molecular Orbital, energi LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital, dan momen dipol menggunakan aplikasi Hyperchem. Setelah struktur training sets dibuat, kemudian pilih Build  add H and model build. Sebelum dilakukan perhitungan deskriptor, dilakukan optimasi struktur dengan metode semiempiris AM1 dan optimasi geometri. Pemilihan metode semiempiris AM1, karena metode tersebut sering digunakan dan merupakan metode semiempiris standar untuk perhitungan senyawa organik Bultink et al., 2004. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Proses optimasi struktur berfungsi untuk mendapatkan struktur yang stabil ketika dilakukan perhitungan parameter elektroniknya, sehingga hasil perhitungan deskriptor yang didapat sesuai dengan sifat- fisika kimia senyawa yang sebenarnya. Proses perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO dengan cara, pilih Compute kemudian pilih Orbitals. Sedangkan untuk momen dipol, pilih Compute  Single Point  Properties. Kemudian, pemilihan deskriptor yang mewakili parameter sterik adalah Molar refractivity, Harary Index, dan Randic Index. Pehitungan molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dengan cara, pilih Compute  QSAR Properties  Refractivity  klik Compute. Sedangkan untuk Harary Index dan Randic Index menggunakan aplikasi MarvinSketch. Setelah struktur dibuat dan telah di-clean 3D, pilih tools  GeometryTopological analysispilih Harary Index dan Randic Index Ok. Semua data kemudian dikumpulkan pada program SPSS dan Microsoft Excel, yang nantinya digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Selanjutnya, aktivitas senyawa yaitu nilai MIC diubah menjadi Log 1MIC sebagai variabel tak bebas dan 7 data deskriptor sebagai variabel bebas. Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training set No Kode Senyawa Log 1MIC logD Energi HOMO Energi LUMO Momen dipol Harary index Randic index Molar refractivity 1 S1 -2.686 2.71 -8.943 -0.639 2.346 39.412 12.815 63.09 2 S2 -2.431 -0.665 -9.471 -0.793 2.679 25.102 8.734 47.2 3 S6 -2.412 0.183 -9.394 -0.615 2.02 47.893 14.695 72.69 4 S15 -2.350 2.207 -9.059 -0.731 3.731 32.25 10.419 53.57 5 S9 -2.236 0.237 -9.215 -0.784 4.055 47.233 14.695 72.69 6 S13 -2.188 1.36 -8.974 -0.847 5.397 29.204 9.272 49.48 7 S12 -2.049 2.205 -9.304 -0.72 1.099 32.639 10.419 53.57 8 S10 -1.91 3.719 -8.922 -0.642 3.029 50.65 15.842 77.46 9 S8 -1.825 1.845 -8.97 -0.71 3.959 66.316 20.222 96.49 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.1.3 Membangun dan validasi Persamaan HKSA

Persamaan HKSA yang dibuat dengan cara analisa regresi multiliner dengan metode backward dibantu oleh program SPSS. Pemilihan analisa regresi multilinier dikarenakan dalam pembuatan persamaan, parameter-parameter sifat fisika-kimia yaitu data deskriptor yang digunakan lebih dari satu. Sembilan data akitivitas Log 1MIC senyawa training sets dengan masing-masing memiliki 7 data deskriptor di input pada program SPSS. Kemudian dilakukan analisa statistic regresi multiliner metode backward dengan cara, pilih analyze RegressionLinier pilih dependent variabel adalah aktivitas senyawa Log 1MIC dan independent variabel adalah 7 deskriptor yang digunakanubah method menjadi backwardOk. Hasil yang didapat dari program SPSS adalah 3 model persamaan HKSA dengan nilai r, r 2 , F hitung , SE Standar Error, dan Deskriptor yang digunakan. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5. Model persamaan yang diterima dalam penelitian HKSA adalah yang memiliki nilai r diantara 0,9 hingga 1, nilai r 2 antara 0,8 hingga 1, nilai standar error SE 1 atau mendekati 0, dan nilai F hitung lebih kecil dari F tabel atau F hit F tab 1. Nilai r koefisien kolerasi menunjukkan tingkat hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisa regresi. Sedangkan nilai r 2 menunjukkan persentase aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan sifat fisika kimia yang digunakan Siswandono, 2008; Rifai. et al., 2014. Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA Model Deskriptor yang digunakan r r 2 SE Fhit Ftab FhitFtab 1 Log D, energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary Index, Randic Index, Molar refractivity 0.994 0.988 0.083 12.218 237 0.052 2 Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic Index, Molar refractivity 0.992 0.985 0.0679 21.179 19.33 1.096 3 Log D, energi HOMO, energi LUMO , Randic Index, Molar refractivity 0.988 0.976 0.0684 24.906 9.01 2.764 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.6 Model Persamaan Keterangan: EH = energi HOMO, EL = energi LUMO, MD = momen dipole, HI = Harary Index , RI = Randic Index, MR = Molar refractivity Dari hasil analisa yang didapat, model persamaan yang memenuhi syarat adalah persamaan model 2 dan 3. Karena pada persamaan model 1, nilai FhitFtab kurang dari 1 yaitu 0,052. Hal ini dikarenakan nilai F menunjukkan kemungkinan persamaan tersebut adalah suatu hubungan yang bermakna diantara hasil-hasil yang didapat. Jika nilai F perhitungan data percobaan lebih besar dari nilai F tabel maka hasil- hasil percobaan mempunyai hubungan yang besar pada tingkat probabilitas yang diberikan Siswandono, 2008. Setelah dilakukan validasi pada data output SPSS dilakukan uji PRESS prediction sum of squares dengan menggunakan data aktivitas senyawa training sets berdasarkan eksperimen Log 1MIC eksperimen dan data aktivitas senyawa training sets dengan menggunakan model persamaan yang terpilih Log 1MIC prediksi, yaitu model 2 dan 3. Perhitungan nilai PRESS dengan menggunakan rumus: Σ{log 1MIC eksperimen – Log 1MIC prediksi} 2 Model Bentuk Persamaan 1 log1MIC = -14.130+0.251logD-0.693EH-3.027EL-0.068MD+0.044HI- 1.364RI+0.294MR 2 log1MIC = -18.7+0.298logD-1.22EH-2.812EL+0.034HI-1.106RI+0.243MR 3 log1MIC = -19.106+0.302logD-1.226EH-2.828EL-1.083RI+0.265MR UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.7 Data Nilai PRESS Kode Senyawa Log1MIC eksperimen Log1MIC prediksi Model 2 Model 3 S1 -2.686 -2.688 -2.676 S2 -2.431 -2.450 -2.404 S6 -2.412 -2.416 -2.446 S15 -2.350 -2.344 -2.354 S9 -2.236 -2.166 -2.172 S13 -2.188 -2.203 -2.227 S12 -2.049 -2.064 -2.085 S10 -1.910 -1.878 -1.859 S8 -1.825 -1.874 -1.874 Nilai PRESS 0.009 0.014 Dari tabel 4.7 diketahui nilai PRESS yang terkecil atau mendekati 0 adalah model 2 yaitu 0,009. Nilai PRESS yang kecil menandakan aktivitas prediksi dari suatu persamaan HKSA mendekati aktivitas eksperimen. Untuk memvalidasi lagi model persamaan yang terpilih, maka dilakukan uji diluar data senyawa pembuat persamaan HKSA yaitu pada data test sets. Sebanyak 5 data tes sets yang digunakan dihitung data deskriptor terpilih dari persamaan model 2 dan 3, yaitu; Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic Index, dan Molar refractivity. Setelah semua data deskriptor terkumpul, maka dilakukan perhitungan aktivitas yaitu nilai Log 1MIC prediksi senyawa tes set menggunakan persamaan model 2 dan 3 untuk mendapat nilai RMSD root mean square deviation terkecil, dengan membandingkannya pada Log 1MIC eksperimen senyawa tes set. Perhitungan RMSD dengan rumus: n = jumlah senyawa test sets yang digunakan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set Kode Senyawa log1MIC logD Energi HOMO Energi LUMO Harary Index Randic Index Molar Refractivity S4 -2.563 -1.322 -9.323 -0.889 28.921 9.272 48.8 S3 -2.494 -1.77 -9.086 -0.947 38.024 10.103 52.79 S16 -2.236 -0.19 -9.172 -0.816 47.233 14.695 72.69 S14 -2.086 -1.309 -9.316 -0.942 29.136 9.272 48.8 S7 -1.935 0.186 -8.973 -0.713 46.751 14.695 72.69 Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set Kode Senyawa Log1MIC eksperimen Log1MIC prediksi Model 2 Model 3 S4 -2.563 -2.633 -2.671 S3 -2.494 -2.533 -2.775 S16 -2.236 -2.255 -2.263 S14 -2.086 -2.481 -2.526 S7 -1.935 -2.692 -2.684 Nilai RMSD 0.384 0.411 Dari hasil RMSD dapat diketahui bahwa model persamaan dengan nilai RMSD kecil adalah model persamaan 2, hal ini sesuai dengan hasil uji PRESS, dimana model persamaan 2 memiliki nilai PRESS terkecil. Sehingga dapat disimpulkan dari hasil validasi model persamaan, persamaan 2 telah memenuhi syarat pemodelan persamaan HKSA. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Log1MIC = -18.7 + 0.298logD - 1.22Energi HOMO - 2.812Energi LUMO + 0.034Harary Index - 1.106Randic Index + 0.243MolarRefractivity r = 0.992; r 2 = 0.98; SE = 0.0679; FhitFtab = 1.096 Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa semakin besar nilai deskriptor log D, Harary index, dan Molar refractivity akan meningkatkan aktivitas anti tuberkulosis. Sedangkan semakin kecil nilai deskriptor energi HOMO, energi LUMO, dan Randic Index akan meningkatkan aktivitas anti tuberculosis. Hal ini dikarenakan koefisien pada setiap deskriptor mempengaruhi nilai aktivitas suatu senyawa.

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets

Sampel yang digunakan yaitu 11 senyawa amidasi EPMS dan EPHS etil p-hidroksisinamat dibuat bentuk strukturnya dan dihitung nilai deskriptor terpilih pada persamaan HKSA kedua. Senyawa yang diujikan merupakan senyawa yang dimungkinkan dapat disintesis, sehingga nantinya dapat dilakukan uji in-vitro aktivitas anti- tuberkulosis pada senyawa tersebut. R² = 0.9843 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 Log 1MIC eksperimen Log 1MIC prediksi Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log 1MIC eksperimen dan Log 1MIC prediksi dengan model persamaan HKSA 2 pada 9 senyawa training sets. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Sebelum melakukan proses perhitungan deskriptor pada Hyperchem maupun Marvinsketch, dilakukan optimasi yang sama seperti perhitungan deskriptor pada training sets dan test sets, yaitu menggunakan metode semiempirik AM1 pada Hyperchem dan dilakukan clean 3D pada marvin sketch. Setelah semua data deskriptor di dapat, dengan menggunakan Microsoft excel semua data direkapitulasi dan dilakukan perhitungan MIC prediksi senyawa sampel. Tabel 4.10 Data sample sets No. Kode Senyawa Nama IUPAC Struktur 1 Amida_1 2E-3-4-methoxyphenylprop-2- enamide 2 Amida_2 2E-N-hydroxy-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide 3 Amida_3 2E-3-4-methoxyphenyl-N-methylprop- 2-enamide 4 Amida_4 2E-3-4-methoxyphenyl-N,N- dimethylprop-2-enamide 5 Amida_5 2E-N-hydroxymethyl-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide 6 Amida_6 2E-N,N-bishydroxymethyl-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 7 Amida_7 2E-N-2-hydroxyethyl-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide 8 Amida_8 2E-N,N-bis2-hydroxyethyl-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide 9 Amida_9 2E-N-benzyl-3-4-methoxyphenylprop- 2-enamide 10 Amida_10 ethyl 2E-3-4-aminophenylprop-2- enoate 11 Amida_11 2E-N,N-dibenzyl-3-4- methoxyphenylprop-2-enamide 12 EPHS ethyl 2E-3-4-hydroxyphenylprop-2- enoate Catatan: Untuk mempermudah analisa data, nama senyawa IUPAC diganti dengan kode senyawa Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets No. Kode Senyawa Log D Energi HOMO Energi LUMO Harary Index Randic Index Molar Refractivity 1 Amida_1 1.171 -8.866 -0.484 32.302 10.791 55.4 2 Amida_2 1.165 -9.01 -0.737 35.874 11.329 56.87 3 Amida_3 1.395 -8.842 -0.468 35.874 12.003 60.29 4 Amida_4 1.619 -8.862 -0.505 39.946 13.214 65.19 5 Amida_5 0.815 -8.942 -0.544 39.412 12.563 61.39 6 Amida_6 0.459 -9.022 -0.546 47.938 14.335 67.39 7 Amida_7 0.705 -8.862 -0.491 42.951 13.813 66.58 8 Amida_8 0.239 -8.891 -0.472 56.083 16.835 77.77 9 Amida_9 3.12 -8.874 -0.279 60.358 16.678 89.04 10 Amida_10 2.043 -8.527 -0.528 35.697 12.041 60.27 11 Amida_11 5.068 -8.673 -0.204 97.07 22.565 122.69 12 EPHS 2.564 -9.039 -0.698 35.697 11.669 58.32 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA 2 No. Kode Senyawa log1MIC MIC prediksi μM 1 Amida_11 2.122 0.008 2 Amida_9 -0.916 8.249 3 EPHS -2.466 292.434

4 Amida_2

-2.779 601.082 5 Amida_4 -3.401 2518.767 6 Amida_1 -3.548 3530.954

7 Amida_3

-3.586 3856.257 8 Amida_5 -3.655 4519.205 9 Amida_10 -3.662 4587.203 10 Amida_6 -3.870 7410.952 11 Amida_7 -3.935 8619.499 12 Amida_8 -4.269 18581.125 Keterangan: MIC EPMS = 485 μM Dari tabel diatas dapat dilihat 3 senyawa yang memiliki nilai MIC terkecil bila dibandingkan dengan EPMS, yaitu Amida_11, Amida_9, dan EPHS. Prediksi aktivitas pada senyawa amida_11 adalah 0,008 μM, amida_9 adalah 8,249 μM, dan EPHS adalah 292,434 μM. Bila dilihat dari data deskriptor yang berpengaruh terhadap aktivitas, pada amida_11 terdapat deskriptor yang memiliki nilai yang besar yaitu Log D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity. Hal ini berbanding lurus dengan persamaan yang digunakan, semakin besar deskriptor Log D, Harary index, dan Molar refractivity, aktivitas semakin besar MIC kecil.Walaupun nilai randic index senyawa amida_11 besar yang seharusnya kecil, hal ini tidak terlalu berpengaruh dan juga untuk nilai deskrptor lainnya tidak terlalu berbeda nilainya dengan deskriptor senyawa lain. Pada amida_9 sama seperti dengan senyawa amida_11 deskriptor yang memiliki nilai terbesar adalah Log D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Untuk senyawa EPHS etil p-hidroksi sinamat, peneliti mencoba melihat pengaruh modifikasi pada gugus metoksi pada cincin benzene EPMS, yaitu menggantinya dengan gugus hidroksi pada posisi para. Terlihat bahwa hal ini mempengaruhi nilai energi HOMO dan energi LUMO yang lebih kecil dari senyawa lainnya. Sedangkan untuk deskriptor lainnya, nilainya tidak terlalu berbeda dengan deskriptor senyawa lain. Tetapi peningkatan aktivitas pada EPHS tidak terlalu jauh dengan MIC EPMS, sehingga perubahan gugus metoksi menjadi hidroksi tidak terlalu berpengaruh pada aktivitas anti-tuberkulosis. EPMS EPHS Amida_9 Amida_11 Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11 Penelitian yang dilakukan oleh De et al., 2011, tentang desain, sintesis, dan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa turuan asam sinamat baru, menyatakan bahwa gugus samping pada posisi para cincin benzene asam sinamat berperan penting terhadap sifat lipofilitas senyawanya. Sedangkan gugus samping karbonil asam sinamat, yang pada penelitian ini digantikan oleh gugus amina, merupakan gugus mirip obat drug-like molecule yang berperan penting dalam aktivitas anti tuberkulosisnya. Berdasarkan hal itu, pada amida_9 dan amida_11 memiliki aktivitas yang baik kemungkinan karena adanya gugus benzilamin dan dibenzilamin yang memiliki kemiripin dengan struktur isoniazid. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.2 Penambatan molekuler 4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A