Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF

STRUKTUR-AKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA

AMIDASI ETIL

P

-METOKSISINAMAT DENGAN

PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN

MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI

WAHIDIN SALEH

NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF

STRUKTUR-AKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA

AMIDASI ETIL

P

-METOKSISINAMAT DENGAN

PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN

MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI

Diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far)

WAHIDIN SALEH

NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

Nama : Wahidin Saleh Program Studi: Farmasi

Judul : Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan

Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A

Telah dilakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil p

-metoksisinamat dengan Metode Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) Hansch dan penambatan molekuler pada Enzim Inh A. HKSA di analisa dengan regresi multilinier menggunakan program SPSS. Penambatan molekuler di analisa dengan program autodockvina dan divisualisasi dengan program Pymol dan Ligplot. Hasil persamaan HKSA terbaik adalah Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index)

- 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Hasil penambatan molekuler,

menunjukkan senyawa ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide)

memiliki nilai ΔGbind terendah (-9,4 kcal/mol) dan hasil dari HKSA memiliki nilai

MIC prediksi terkecil (0,008 μM). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut diprediksikan memiliki aktivitas anti-tuberkulosis yang potensial dibandingkan oleh EPMS.

Name : Wahidin Saleh Program Study : Pharmacy

Title : Quantitative Structure-Activity Relationship study of amidation derivate of Ethyl p-methoxycinnamate on its Anti-tuberculosis using Hansch analysis and molecular docking at Inh A enzyme.

The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives ethyl p-methoxycinnamate has been determined by using Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) Hansch’s method and molecular docking at Inh A enzyme. QSAR was analyzed by multilinier regression using SPSS. Molecular docking was analyzed by autodockvina program and visualized by Pymol dan Ligplot program. The best QSAR equation is Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energy HOMO) - 2.812(Energy LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Results of molecular docking, indicated that ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide) compound has the lowest _ΔGbind value (-9.4 kcal / mol) and the result of QSAR has the smallest MIC predictive value (0,008 μM). It’s suggested that this compound have potential anti-tuberculosis activity compared by EPMC.

Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan kita, Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan

Molekuler pada Enzim Inh A_{”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir} sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Kedua orang tua bapak dan ibu tercinta, Bapak Mamat dan Ibu Tri Larasati yang telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril maupun materi, tiada yang bisa penulis balas atas semua pemberiannya, hanya ucapan terimakasih ini yang bisa penulis sampaikan.

2. Bapak Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing I dan Ibu Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Bapak Professor Dr. Dede Rosyada, MA selaku rektor UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

8. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra M.Sc dan Kak Fikri yang turut membantu dan menambahkan ilmu tentang penelitian ini.

9. Teman-teman seperjuangan “Docking Team”: Eko, Cacad, Haidar, Mazaya, dan Wahyu yang telah memberikan waktu dan pikiran untuk saling sharing permasalahan dan ilmu tentang penelitian ini.

10.Teman satu kontrakan dan bermain: Ali, Rijal, Mozer, Andis, Rais, Galih, Ari, Akas, dll.

11.Teman belajar selama kuliah: Reza, Echa, Aziz, Fio, Achi, Nicky, Ayu, Henny, Ichob, Wina, Gina, Merri, dll.

12.Teman-teman Farmasi 2011, khususnya untuk kelas C atas kebersamaan dan memori selama menempuh ilmu dikampus ini.

13.Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mba Rani, dan Ka Rahmadi yang banyak membantu selama penelitian dan praktikum semester sebelumnya.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Ciputat, Juni 2015

HALAMAN JUDUL ... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISIONALITAS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEBIMBING ... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ... v

ABSTRAK ... vi

ABSTRACT ... vii

KATA PENGANTAR ... viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI... x

DAFTAR ISI ... xi

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

DAFTAR ISTILAH ... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ... 1

1.1Latar Belakang ... 1

1.2Rumusan Masalah... 4

1.3Tujuan Penelitian ... 4

1.4Manfaat Penelitian ... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ... 5

2.1 Etil p-Metoksisinamat ... 5

2.2 Reaksi Amidasi ... 6

2.3 Tuberkulosis ... 8

2.4 Pengobatan Tuberkulosis ... 9

2.5 Isoniazid ... 10

2.6 Asam Amino, Protein, dan Enzim... 12

2.7 Enzim Inh A ... 17

2.8 Jenis Ikatan ... 18

2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Biologis (HKSA) pendekatan Hansch ... 18

2.9.1 Parameter hidrofobik ... 20

2.9.2 Parameter elektronik ... 21

2.9.3 Parameter sterik ... 22

2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch ... 23

2.9.5 Kriteria Statistik ... 24

2.10Penambatan molekuler (Molecular Docking) ... 25

2.11Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler ... 27

2.11.1 Hyperchem ... 27

2.11.2 Protein Data Bank ... 27

2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer ... 28

2.11.4 Marvin Sketch ... 28

2.11.5 Autodock ... 28

2.11.6 Autodock Vina ... 29

2.11.7 Pymol ... 30

3.2.2 Perangkat Lunak... 31

3.3Bahan ... 32

3.3.1 Struktur molekul tiga dimensi Enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis ... 32

3.3.2 Struktur tiga dimensi Ligan senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat ... 32

3.3.3 Data Anti-tuberculosis beberapa Senyawa beserta strukturnya ... 32

3.4Cara Kerja ... 32

3.4.1 HKSA pendekatan Hansch ... 32

3.4.1.1Pemilihan data sets ... 32

3.4.1.2Pemilihan deskriptor training sets ... 33

3.4.1.3Membangun persamaan HKSA ... 33

3.4.1.4Perhitungan deskriptor test sets ... 33

3.4.1.5Validasi persamaan HKSA ... 34

3.4.1.6Prediksi aktivitas sample sets ... 34

3.4.2 Penambatan Molekul ... 34

3.4.2.1Penyiapan dan optimasi enzim Inh A ... 34

3.4.2.2Penyiapan dan optimasi ligan (Senyawa uji) .... 35

3.4.2.3Penambatan molekul dengan autodock vina .... 35

3.4.2.4Analisa dan visualisasi hasil penambatan molekul ... 36

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ... 37

4.1Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch ... 37

4.1.1 Pemilihan data sets ... 37

4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets ... 40

4.1.3 Membangun dan Validasi persamaan HKSA ... 42

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets ... 46

4.2Penambatan molekul... 51

4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A .... 51

4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji) ... 52

4.2.3 Penambatan molekul dengan Autodock vina ... 56

4.2.4 Analisa dan Visualisasi penambatan molekul ... 57

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ... 63

5.1Kesimpulan ... 63

5.2Saran ... 63

DAFTAR PUSTAKA ... 64

Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat... 5

Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida ... 7

Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting ... 7

Gambar 2.4 Reaksi Sintesis Amida ... 7

Gambar 2.5 Struktur Isoniazid ... 11

Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid... 12

Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino ... 13

Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion ... 21

Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC) prediksi ... 46

Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11 ... 50

Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3 senyawa uji dengan ∆Gbind terendah ... 60

Tabel 2.1 Asam Amino ... 13

Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino ... 15

Tabel 2.3 Penggolongan Enzim ... 16

Tabel 4.1 Data sets yang digunakan ... 37

Tabel 4.2 Data Training sets ... 39

Tabel 4.3 Data test sets... 39

Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training sets... 41

Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA ... 42

Tabel 4.6 Model Persamaan ... 43

Tabel 4.7 Data Nilai PRESS ... 44

Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set ... 45

Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set ... 45

Tabel 4.10 Data sample sets ... 47

Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets ... 48

Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi samplesets menggunakan persamaan HKSA 2 ... 49

Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking ... 53

Tabel 4.14 Hasil penambatan molekuler ... 58

Lampiran 1. Alur Penelitian ... 68

Lampiran 2. Prosedur Kerja HKSA ... 70

Lampiran 3. Prosedur Kerja Penambatan Molekuler ... 77

EPHS Etil p-hidroksisinamat

EPMS Etil p-metoksisinamat

HKSA Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktifitas

HOMO Highest Occupied Moleculer Orbital

INH Isoniazid

LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital

MIC Minimum Inhibitor Concentration

NADH Nicotinamide Adenin Dinucleotide

PDB Protein Data Bank

PRESS Predicted Residual Sums of Squares

RMSD Root Mean Square Deviation

SE Standard Error

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tuberkulosis adalah suatu penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri basil tahan asam Mycobacterium tuberculosis serta bertahan dalam

tubuh manusia selama bertahun-tahun, ditularkan melalui droplet yang mengandung basil tersebut (airborne disease). Sebagian besar kuman TB

menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Depkes RI, 2011). Genus Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena

dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Dalam jaringan tubuh

kuman Mycobacterium tuberculosis dapat mengalami fase dorman

(tertidur lama) selama beberapa tahun (Poeloengan et al., 2007; Depkes

RI, 2002).

Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh

Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah

dilaporkan pada WHO. Dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien dengan diagnosa baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia. (Depkes RI, 2011; WHO, 2014).

Obat yang umum dipakai pada pengobatan tuberkulosis adalah Isoniazid, Etambutol, Rifampisin, Pirazinamid, dan Streptomisin. Kelompok obat ini disebut sebagai obat primer. Isoniazid adalah obat TB yang paling poten dalam hal membunuh bakteri dibandingkan dengan rifampisin dan streptomisin (Depkes RI, 2005).

Isoniazid bekerja dengan menghambat biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium. Beberapa hipotesis diajukan berkaitan dengan mekanisme kerja isoniazid, diantaranya adalah efek pada lemak, biosintesis asam nukleat dan glikolisis. (Goodman and Gilman, 2005; Katzung, B., 2004).

Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting yang

terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis.

Adanya isoniazid yang berikatan dengan kofaktor Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH) membentuk INH-NAD akan menghambat aktivitas

enzimatik Inh A, sehingga akan mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakterium (He et al,

2007).

Etil p-metoksisinamat (EPMS) yang merupakan salah satu zat

kimia dari rimpang kencur (Kaempferia galanga), telah dilaporkan tidak

hanya memiliki aktivitas analgesik-anti inflamasi seperti NSAID yang

menghambat siklooksigenase, tetapi juga menghambat proliferasi sel tumor dalam spesimen epidermis tikus, selain itu juga memiliki aktivitas biologis terhadap penghambatan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis dan Candida albicans (Dash et al., 2014). Hasil dari

penelitian Lakhsmanan et al., (2011), Etil p-metoksisinamat diprediksikan

memiliki sifat anti-tuberkulosis dengan mekanisme yang mirip dengan isoniazid, yaitu berpengaruh terhadap proses biosintesis asam mikolat.

Berdasarkan penelitian tersebut, peneliti tertarik untuk melakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa hasil modifikasi struktur dari reaksi amidasi senyawa EPMS sebagai senyawa penuntunnya (lead compound),

yang telah diketahui memilki aktivitas anti-tuberkulosis. Salah satu cara untuk memberikan informasi aktivitas biologis suatu senyawa adalah dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA).

HKSA merupakan bagian penting rancangan obat dalam usaha mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, faktor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).

Selain dengan pendekatan HKSA antara senyawa turunan amidasi EPMS dengan senyawa turunan asam sinamat yang memiliki aktivitas anti-tuberkulosis, diketahui juga penentuan aktivitas bisa menggunakan metode penambatan molekuler (molecular docking). Senyawa amidasi

EPMS akan digunakan sebagai ligan yang akan diprediksi hasil penambatannya dengan suatu makromolekul, yaitu enzim Inh A yang terdapat di M. tuberculosis, kemudian divisualisasi interaksi

ligan-makromolekul dengan menggunakan program Pymol dan LigPlot. Hasil dari penelitian ini, diharapkan akan mendapatkan senyawa amidasi EPMS yang memiliki prediksi aktivitas yang baik untuk pengobatan anti-tuberkulosis dengan metode HKSA Hansch dan penambatan molekul pada enzim Inh A. Sehingga, senyawa tersebut pada penelitian selanjutnya dapat disintesis dan diuji secara in-vitro dan in-vivo terhadap aktivitas

1.2 Rumusan Masalah

Apakah senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas

anti-tuberkulosis dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas pendekatan Hansch dan melalui penambatan molekuler pada enzim Inh A?

1.3 Tujuan Penelitian

a. Memperoleh hubungan kuantitatif struktur-aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan pendekatan Hansch.

b. Melihat interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan

enzim Inh A dalam penghambatan pembentukan asam mikolat

Mycobacetrium tuberculosis.

1.4 Manfaat Penelitian

a. Memberikan informasi acuan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat

yang akan disintesis dan diujikan secara in-vitro untuk aktivitas

anti-tuberkulosis.

b. Membantu dalam memberi informasi pada pembuatan obat anti-tuberkulosis baru.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil p-metoksisinamat

Senyawa etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan

senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air dan heksana, termasuk turunan asam sinamat, dimana asam sinamat adalah turunan senyawa phenil propanoad. Senyawa-senyawa yang termasuk turunan sinamat adalah para hidroksi sinamat, 3,4-dihidroksisinamat, dan 3,4,5 trimetoksisinamat (Barus, 2009).

Tanaman kencur memang mengandung senyawa tabir surya yaitu etil p-metoksisinamat, yang telah dibuktikan kebenarannya

oleh pengalaman nenek moyang kita. Etil p-metoksisinamat (EPMS)

adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur yang merupakan bahan dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. (Barus, 2009). Umar et al, (2014)

menyatakan bahwa Etil p-metoksisinamat memilki potensi

anti-inflamasi dengan menghambat sitokin proanti-inflamasi dan angiogenesis, sehingga menghambat fungsi utama dari sel endotel. Dengan demikian, etil p-metoksisinamat bisa menjadi agen terapi

yang menjanjikan untuk pengobatan penyakit inflamasi dan Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat (Barus, 2009)

Sebagai antimikroba, Etil p-metoksisinamat diisolasi dari

ekstrak Kampheria galanga memiliki aktivitas yang cukup terhadap Mycobacterium tuberculosis dan Candida albicans. (Kanjanapothi et al., 2004; Techaprasan et al., 2010). Baru-baru ini, Etil

p-metoksisinamat dengan uji microtiter resazurin telah terbukti

menghambat isolat klinis pasien multidrug resistant (MDR) dari Mycobacterium tuberculosis dengan konsentrasi hambat minimum

(MIC) dari 0,242-0,485 mM. (Lakshmanan et al., 2011). Aktivitas

larvasida Etil p-metoksisinamat telah ditunjukkan oleh Kim et al.,

(2008), sekitar (LC50 = 12,3-20,7 mg/L) terhadap A. aegypti, O.

togoi dan C. pipens pallens. Namun, etil-sinamat dan 3-Carene

memiliki aktivitas larvasida yang lebih (LC50 = 24,1 dan 21,6 mg/L masing-masing) terhadap C. pipens pallens tapi kurang aktivitas

(LC50=40-60 mg/L) terhadap A. aegypti dan O. togio.

2.2 Reaksi Amidasi

Proses amidasi adalah suatu reaksi penambahan gugus aktif amin dengan pengantian atom nitrogen pada gugus karbonil dengan struktur R_–CO_{–NR R . Amin merupakan senyawa organik dan} memiliki gugus fungsional yang mengandung atom Nitrogen. Amin adalah turunan ammonia dengan salah satu atom hidrogen diganti dengan alkil atau aril (David, 2007). Amida adalah suatu senyawa yang mempunyai suatu nitrogen trivalent yang terikat pada gugus karbonil.

Suatu amida diberi nama dari nama asam kaboksilat induknya, dengan mengubah imbuhan asam …-oat (atau -at)

menjadi –amida. Amida di sintesa dari derivat asam karboksilat dan

Berikut ini beberapa amida yang penting, gugus amidanya dilingkari:

Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999). Contoh reaksi pembuatan amida adalah seperti di bawah ini:

Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida (Fessenden, 1999) a. IUPAC: etanamida b. IUPAC: butanamida

Trivial: asetamida Trivial: butiramida

a. b.

a. _b.

c.

Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting (Fessenden, 1999): a. nikotinimida b. kafeina c. LSD

2.3 Tuberkulosis

Tuberkulosis atau TB adalah penyakit bakteri menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yang paling sering

menyerang paru-paru. Hal ini ditularkan dari orang ke orang melalui droplet dari tenggorokan dan paru-paru orang dengan penyakit pernapasan aktif. Pada orang yang sehat, infeksi Mycobacterium tuberculosis sering tidak menimbulkan gejala, karena sistem kekebalan tubuh seseorang bertindak sebagai "wall off" bakteri.

Gejala TB aktif paru seperti batuk, kadang-kadang dengan sputum atau darah, nyeri dada, kelemahan, penurunan berat badan, demam dan berkeringat di malam hari. Tuberkulosis bisa diobati dengan program antibiotik enam bulan (WHO, 2015).

Tuberkulosis (TB) adalah penyakit infeksius, yang terutama menyerang penyakit parenkim paru (Brunner et al., 2002).

Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh Mycobacterium tuberkulosis. Pada tahun 1995, diperkirakan ada 9 juta pasien TB baru dan 3 juta kematian akibat TB diseluruh dunia.

Diperkirakan 95% kasus TB dan 98% kematian akibat TB didunia, terjadi pada negara-negara berkembang. Demikian juga, kematian wanita akibat TB lebih banyak dari pada kematian karena kehamilan, persalinan dan nifas. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah dilaporkan pada WHO, dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien dengan diagnosis baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan.Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia. Diperkirakan, setiap tahun ada 429.730 kasus baru dan kematian 62.246 orang. Insidensi kasus TB BTA positif sekitar 102 per 100.000 penduduk. (Depkes RI 2011; WHO 2014).

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri aerob obligat

yang pertumbuhannya di bantu oleh tekanan CO2 5-10 %, tetapi di hambat oleh pH di bawah 6,5 dan asam lemak rantai panjang. Basil tuberkel tumbuh hanya pada suhu 35-37ºC, yang sesuai dengan kemampuannya menginfeksi organ dalam terutama paru. Genus

Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya

kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat.

Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium.

Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Robert Koch pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya bakteri tersebut diberi nama basil Koch (Poeloengan et al., 2007). Mycobacterium tuberculosis ini berbentuk batang, berukuran

panjang 1-4 mikron dan tebal 0,3-0,6 mikron, mempunyai sifat khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan. Oleh karena itu disebut pula sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Secara khas kuman membentuk granula dalam paru menimbulkan nekrosis atau kerusakan jaringan. Kuman TB cepat mati dengan sinar matahari langsung, tetapi dapat bertahan hidup beberapa jam di tempat gelap dan lembab. Dalam jaringan tubuh dapat mengalami fase dorman selama bertahun-tahun (Suarni, 2009; Depkes RI, 2002).

2.4 Pengobatan Tuberkulosis

Pengobatan TB bertujuan untuk menyembuhkan pasien, mencegah kematian, mencegah kekambuhan, memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya resistensi kuman terhadap Obat Anti Tuberkulosis (OAT) (Depkes RI, 2011). Pengobatan terhadap TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu lini pertama dan lini kedua.

Kelompok lini pertama, yaitu isoniazid, rifampisin, etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok lini pertama ini efektifitasnya tinggi, toksisitas dapat ditolerir. Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon, sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin, kapreomisin, dan para aminosalisilat (Niemann, S. dan Gerdes, S.R., 2003).

Pengobatan tuberkulosis dilakukan dengan prinsip-prinsip sebagai berikut:

a. Obat anti TB (OAT) harus diberikan dalam bentuk kombinasi beberapa jenis obat, dalam jumlah cukup dan dosis tepat sesuai dengan kategori pengobatan. Jangan gunakan OAT tunggal (monoterapi). Pemakaian OAT-Kombinasi Dosis Tetap (OAT-KDT) lebih menguntungkan dan sangat dianjurkan.

b. Untuk menjamin kepatuhan pasien menelan obat, dilakukan pengawasan langsung (DOT = Directly Observed Treatment) oleh seorang Pengawas Menelan

Obat (PMO).

c. Pengobatan TB diberikan dalam 2 tahap, yaitu tahap intensif dan lanjutan.

2.5 Isoniazid

Isoniazid (Hydrazide Penisilamin, INH) telah digunakan

sebagai anti-tuberkulosis yang paling umum sejak pengakuan tentang aktivitas klinisnya pada tahun 1952 (Robitzek et al., 1952).

Terdiri dari cincin piridin dan gugus hydrazide, INH adalah analog nikotinamid, secara struktural terkait dengan obat anti-TB Etionamid dan pirazinamid (Kolyva et al., 2012).

Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis. Sering digunakan dalam bentuk kombinasi. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 300 mg per hari melalui oral pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi, yakni: 5 mg/kg per hari (WHO), 10 mg/kg per hari di Inggris dan 10 mg/kg hingga 15 mg/kg per hari di Amerika Serikat (USA), dengan semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari (Sweetman, 1999).

INH merupakan obat anti tuberkulosis yang bersifat pro-drug

dimana obat ini akan dirubah menjadi metabolit aktifnya didalam sel supaya menjadi substansi yang toksik untuk sel mikobakterial. INH yang telah aktif ini nantinya akan mempengaruhi sintesis asam mikolat. Asam mikolat ini merupakan salah satu komponen penting untuk pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010).

Setelah masuk ke dalam sel mikobakterium, INH dirubah menjadi bentuk aktifnya oleh enzim katalase–peroksidase (Kat G) dimana enzim ini dikode oleh gen katG. INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide ( NADH )

yang merupakan suatu kofaktor yang terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH_– NAD. Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase

merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen InhA.

Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010).

2.6 Asam amino, protein, dan enzim

Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (−COOH) dan satu atau lebih gugus amino (−NH2) yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus karboksil (atom C alfa). Asam-asam amino bergabung melalui ikatan peptida yaitu ikatan antara gugus karboksil dari asam amino dengan gugus amino dari asam amino yang disampingnya (Sudarmadji, 1989). Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Demikian amina pula umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik (Poejiadi, 1994).

Ada dua struktur kimia asam amino, yaitu struktur yang tidak bermuatan dan struktur ion pada pH fisiologis. Gugus karboksil bersifat sebagai sebagai donor proton; gugus amino bersifat sebagai akseptor proton; dan gugus R yang dikenal sebagai rantai samping atau rantai cabang mempunyai sifat yang khas (Sumardjo, 2008).

Di alam, terdapat sekitar 300 jenis asam amino. Namun ternyata hanya 20 asam amino yang secara alami merupakan bahan pembangun protein. Asam amino pembangun atu penyusun protein adalah alfa asam amino, yaitu asam amino yang gugus anionnya terikat pada atom karbon alfa (Sumardjo, 2008).

Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino (Sumardjo, 2008)

Rantai samping atau rantai cabang asam-asam amino mempunyai sifat yang khas. Berdasarkan sifat yang khas tersebut, asam-asam amino diklasifikasikan menjadi tiga kelompok: asam amino yang bersifat basa yaitu asam amino dengan rantai samping mengandung gugus anion atau lingkar heterosiklik berupa hetero atom nitrogen; asam amino yang bersifat asam, yaitu asam amino dengan rantai samping mengandung gugus karboksil; dan asam amino netral, yaitu asam amino dengan rantai samping selain yang telah disebutkan (Sumardjo, 2008).

Protein merupakan makrobiomolekul asam-asam alfa amino dengan susunan yang kompleks dan berat molekulnya sekitar 5000 sampai beberapa juta. Struktur tiga dimensi protein tersebut dapat dijelaskan dengan mempelajari tingkat organisasinya, yaitu menyangkut struktur primer, sekunder, tersier, dan quartener. Struktur primer protein adalah jumlah, jenis, serta urutan asam amino yang membentuk rantai polipeptida. struktur primer menentukan sifat dasar berbagai macam protein. Struktur sekunder adalah struktur yang berikatan kovalen dan berikatan hydrogen dari polipeptida dalam molekul protein dan dapat berbentuk spiral (α -heliks) atau lembaran (zig-zag).

Struktur tersier terbentuk karena terjadi pelipatan rantai polipetida sehingga membentuk protein globular. Struktur kuartener protein dibentuk oleh dua atau lebih rantai polipeptida saling dihubungkan oleh ikatan elektrostatik dan ikatan hidrogren. Dalam struktur kuartener protein yang kompleks, gaya van der walls di antara atom-atom yang berdekatan kemungkinan ikut berperan (Sumardjo, 2008).

Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya (Lehninger, 1995).

Penggolongan enzim secara internasional telah dilakukan secara sistematis. Sistem ini menempatkan semua enzim ke dalam enam kelas utama, masing-masing dengan sub kelas, berdasarkan atas jenis reaksi yang dikatalisa.

2.7 Enzim Inh A

Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting

yang terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Dependent-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan

oleh gen Inha Mycobacterium yang telah diketahui sebagai target

molekul utama dari frontline obat anti tuberkulosis isoniazid (INH).

Penelitian terbaru menunjukkan bahwa Inh A juga sebagai

secondline target untuk obat antitubercular etionamid (ETA). Inh A

mengkatalisis pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Penghambatan

Inh A mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai pro-drug, INH

pertama-tama harus diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase katG ke dalam bentuk aktif radikal asilnya. Produk adisi yang dihasilkan dari ikatan kovalen INH diaktifkan dengan Inh A kosubstrat NADH, atau produk oksidasi NAD+, berfungsi sebagai Inh A inhibitor yang ampuh. (He et al., 2007).

Gen katG berfungsi dalam mengkode enzim catalase-peroxidase (Kat G). Enzim ini berperan dalam merubah INH

menjadi metabolit aktifnya supaya INH bisa berikatan dengan NADH membentuk ikatan INH-NAD. Terjadinya mutasi pada gen katG akan menyebabkan hilangnya aktivitas enzim catalase-peroxidase sehingga INH yang masuk ke dalam sel tidak dapat

dirubah menjadi bentuk aktifnya. INH yang tidak dalam bentuk aktifnya tidak dapat mengganggu aktivitas enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase.

INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH) yang merupakan suatu kofaktor yang

terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH–NAD.

Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase

merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen inhA. Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel.

Setelah terjadi perubahan INH menjadi bentuk aktifnya, maka INH ini akan bekerja pada target utamanya yaitu mengganggu Inh A atau enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase melalui

adanya ikatan kovalen INH-NAD. Dengan adanya ikatan ini maka terjadi hambatan aktivitas enzimatik Inh A sehingga mengganggu sintesis asam mikolat. (Nofriyanda, 2010).

2.8 Jenis Ikatan

Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan dalam interaksi ligan-makromolekul. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan ikatan dipol_–dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001). Selain ikatan tersebut, terdapat ikatan hidrofob yang merupakan salah satu kekuatan penting pada proses penggabungan daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar reseptor biologis (Siswandono, 2008)

2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) pendekatan Hansch

Pendekatan hubungan struktur dan aktivitas biologis mulai berkembang pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh Corwin Hansch dan kawan-kawan, yang menghubungkan struktur kimia dan aktivitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat ionisasi, atau ukuran molekul (Siswandono, 2008).

Analisis Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) merupakan salah satu aplikasi dari kimia komputasi dan juga bagian yang dipelajari dalam bidang kimia medisinal. Dengan metoda analisis HKSA, senyawa yang akan disintesis dapat didesain terlebih dahulu berdasarkan hubungan antara sifat-sifat kimia serta fisik molekul dengan aktivitas biologisnya, dengan menggunakan hubungan tersebut, aktivitas teoritik suatu senyawa baru dapat diprediksi, dan dengan demikian fokus riset dapat dipersempit, biaya dan waktu pun dapat dihemat. Saat ini telah dikenal tiga metoda analisis HKSA yakni metoda HKSA Free-Wilson, metoda Hansch dan metoda HKSA tiga dimensi (Kubinyi, 1993).

Hansch (1963), mengemukakan suatu konsep bahwa hubungan struktur kimia dengan aktivitas biologis (log 1/C) suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui parameter-parameter sifat kimia-fisika dari substituent yaitu para_{meter hidrofobik (π), elektronik (σ) dan sterik (E}s).

Model pendekatan ini disebut juga dengan model hubungan energi bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau

pendeakatan ekstra termodinamika. Pendekatan ini menggunakan dasar persamaan Hammet yang didapat dari kecepatan hidrolisis turunan asam benzoat (Siswandono, 2008).

Proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia. Dalam hubungan struktur dan aktivitas, ketiga parameter tersebut dilibatkan, terutama parameter eketronik dan sterik.

Pendekatan hubungan struktur aktivitas melalui parameter sifat kimia fisika oleh Hansch dinyatakan melalui persamaan regresi linier dibawah ini:

 C : Kadar untuk respons biologis baku

 : Sumbangan sifat-sifat lipofilk, elektronik, dan sterik dari gugus-gugus terhadap sifat-sifat senyawa induk yang berhubungan dengan aktivitas biologis

 a, b, c, dan d : Bilangan yang didapat dari perhitungan analisis regresi linier (Siswandono, 2008).

2.9.1 Parameter hidrofobik

Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi (log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f Rekker-Mannhold dan tetapan kromatografi Rm (Siswandono, 2008). Koefisien partisi oktanol/air yang dinyatakan dalam log P merupakan standar kuantitas untuk menentukan sifat hidrofobik/hidrofilik suatu molekul. Parameter hidrofobik/hidrofilik adalah sifat yang sangat penting dalam aplikasi biomedis (Katritzky et al., 1996).

Koefisien partisi atau log P dapat diartikan sebagai perbandingan konsetrasi suatu senyawa dalam oktanol dan air. Selain log P terdapat juga parameter hidrofobik yang sering digunakan, yaitu koefisien distribusi atau Log D. Koefisien distribusi adalah perbandingan konsentrasi dari seluruh jenis senyawa dalam oktanol dan air. Berdasarkan reaksi disosiasi asam-basa, konsep koefisien partisi digunakan untuk senyawa bersifat kationik, anionic, dan netral (ChemAxon, 2014)

2.9.2 Parameter Elektronik

Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model LFER Hansch, yaitu:

a. Pengaruh berbagai substituent terhadap reaktivitas bagian molekul yang tidak mengalami perubahan. Penetapannya menggunakan perhitungan orbital molekul, contoh : tetapan σ Hammet

b. Sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan ionisasi (pKa) dan berhubungan bentuk terionkan dan tak terionkan dari suatu senyawa pada pH tertentu. Penetapannya menggunakan persamaan Handerson-Hasselbach.

c. Sifat oksidasi-reduksi atau reaktivitas senyawa. Penetapannya menggunakan perhitungan mekanika kuantum dari energi orbital (Siswandono, 2008). Energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital)

dan energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital)

merupakan deskriptor yang sangat populer dalam kimia kuantum. Orbital-orbital ini memainkan peran yang sangat penting dalam menentukan berbagai reaksi kimia dan dalam penentuan celah pita elektronik.

Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion (ChemAxon, 2014)

Energi HOMO berhubungan langsung dengan potensial ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap elektrofil (Katritzky et al, 1996). Sedangkan energi

LUMO berhubungan langsung dengan afinitas elektron dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap nukleofil. Selisih antara energi HOMO dan LUMO (celah HOMO-LUMO) penting dalam penentuan ukuran stabilitas molekul. Molekul dengan celah HOMO-LUMO yang besar berarti molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi, sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksi-reaksi kimia. Celah ini juga digunakan pada perkiraan energi eksitasi terendah molekul (Katritzky et al., 1996).

2.9.3 Parameter sterik

Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugus-gugus dan efek gugus pada kontak obat dengan sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono, 2008). Parameter sterik yang sering digunakan para kimiawan dalam setiap kasus adalah indeks topologi untuk melakukan evaluasi terhadap toksisitas dan untuk memprediksi aktivitas biologi. Hal ini karena indeks topologi menawarkan cara yang mudah dalam pengukuran cabang molekul, bentuk, ukuran, siklisitas, simetri, sentrisitas, dan kompleksitas (Devillers, 1997).

Indeks topologi menjelaskan bahwa suatu struktur kimia, disebut sebagai grafik kimia, yaitu suatu model kimia yang digunakan untuk menjelaskan sifat interaksi antara obyek-obyek kimia (atom, ikatan, gugusan atom, molekul, pasangan molekul, dan sebagainya). Salah satu jenis indeks topologi yang ada adalah indeks harary, Indeks Harary yang dinyatakan dengan H diturunkan dari hubungan timbal balik

(resiprokal) matriks jarak dan dari sejumlah sifat-sifat yang menarik.

Indeks ini berdasarkan pada dugaan para kimiawan bahwa situs-situs yang terletak berjauhan dalam suatu struktur seharusnya memiliki pengaruh yang lebih kecil antara satu dengan lainnya daripada situs-situs yang letaknya berdekatan (Fatimah, 2008).

Indeks Randic atau indeks konektivitas molekular Randic sangat mirip dengan indeks Zagreb, namun lebih dapat diterima dan digunakan secara luas. Secara matematis dituliskan pada persamaan:

Sesuai dengan definisi yang diberikan, maka semakin rapat grafik, maka akan semakin rendah harga χ (Fatimah, 2008). Selain itu descriptor parameter sterik yang biasa digunakan adalah Refraksi molar (molar refraction = MR) Refraksi molar dihitung melalui persamaan Lorenz-Lorenz sebagai berikut:

MR= (n2-1) x BM / (n2-1) x d n : indeks refraksi

d : kerapatan (density) (Siswandono, 2008).

2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch

Perhitungan statistic yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan aktivitas melalui parameter-parameter kimia fisika adalah analisa regresi linier dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan aktivitas biologis melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan statistic dengan bantuan computer, menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR, STATGRAPHIC, STATISTICA, SIGMASTAT, SPSS, atau program statistic lainnya (Siswandono, 2008).

Analisa regresi linier bila dilihat dari jumlah variabel bebas yang digunakan, terbagi menjadi dua yaitu analisa regresi linier tunggal yang menggunakan satu variabel bebas dan analisa regresi multi linier (Multilinier Regresion) yang

menggunakan lebih dari satu variabel bebas. Perhitungan regresi linier digunakan untuk mencari hubungan antara aktivitas biologis dengan satu parameter kimia fisika atau lebih. Salah satu contoh bentuk persamaan untuk regresi multilinier yang menggunakan dua dan tiga parameter adalah sebagai berikut:

Y = aX1+ bX2 + c Y= aX1 + bX2 + cX3 + d

X1, X2, X3 : parameter-parameter kimia fisika 1, 2, dan 3 (Siswandono, 2008).

2.9.5 Kriteria Statistik

Keabsahan persamaan yang diperoleh dan arti perbedaan parameter yang digunakan dalam hubungan struktur-aktivitas model Hansch, dapat dilihat dengan beberapa kriteria statistik, seperti r, r2_{, F, t dan s. arti kriteria statistik:}

a) Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisi regresi. Koefisien korelasi adalah angka bervariasi mulai dari 0 sampai 1. Semakin tinggi nilai koefisien kolerasi maka semakin baik hubungannya.

b) Nilai r2 menunjukkan berapa % aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan parameter sifat fisika-kimia yang digunakan.

c) Nilai F menunjukkan kemaknaan hubungan bila dibandingkan dengan tabel F. Makin besar nilai F makin besar derajat kemaknaan hubungan. Nilai F adalah indikator bilangan untuk menunjukkan bahwa hubungan yang dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah benar atau merupakan kejadian kebetulan. Semakin tinggi nilai F semakin kecil kemungkinan hubungan tersebut adalah karena kebetulan.

d) Nilai t menunjukkan perbedaan koefisien regresi a, b, c, dan d dari persamaan regresi bila dibandingkan dengan tabel t

e) Nilai s (simpangan baku) menunjukkan nilai variasi kesalahan dalam percobaan.

2.10 Penambatan molekuler (Molecular Docking)

Molecular docking atau penambatan molekuler adalah

prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksikan ikatan non kovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dll. Tujuan dari molecular docking adalah untuk

memprediksikan konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar, 2012).

Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode

untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks yang stabil.

Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal.

Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan

jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk

memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam

desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011).

Prediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting karena data tersebut digunakan untuk screening database virtual molekul mirip obat untuk menemukan senyawa penuntun untuk mengembangkan obat selanjutnya. Docking juga dapat digunakan untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar, 2012).

Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-x, atau spektroskopi NMR.

Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan

program docking tergantung pada dua komponen: pencarian

algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi scoring dapat

memprediksi afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan. Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs.

Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari

pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).

2.11 Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler

2.11.1 Hyperchem

Program HyperChem, merupakan program kimia aplikasi

32 bit, yang dikembangkan oleh HyperCube Inc. HyperChem merupakan program yang handal dari pemodelan molekul yang telah diakui mudah digunakan, fleksibel dan berkualitas. Dengan menggunakan visualisasi dan animasi tiga dimensi hasil perhitungan kimia kuantum, mekanika dan dinamika molekular, menjadikan HyperChem terasa sangat mudah digunakan dibandingkan dengan program kimia kuantum yang lain. Program Kimia menyediakan fasilitas pembuatan model tiga dimensi (3D), perhitungan mekanika molekular dan mekanika kuantum (semiempiris dan ab initio). Disamping itu tersedia pula database

dan program simulasi Monte Carlo dan molecular dynamics (MD)

(Pranowo, 2009). 2.11.2 Protein Data Bank

Protein data bank (PDB; http://www.pdb.org) merupakan kumpulan arsip tunggal mengenai data structural makromolekul biologi dari seluruh dunia. Penentuan struktur molekul protein yang terdapat berkas PDB diperoleh dengan menggunakan data eksperimen. Data eksperimen ini berasal dari kristalografi sinar x atau spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).

Kemudian dilakukan proses dengan program komputer untuk membuat molekul yang paling sesuai dengan data eksperimen (Berman et al, 2000). PDB merupakan tempat penampungan data

struktur 3D dari protein dan asam nukleat. Situs PDB dapat diakses pada alamat http://www.pdb.org oleh seluruh pengguna internet seluruh dunia secara gratis (Yanuar, 2012).

2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer

Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain. Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan, data refleksi X-ray, script, dan data lainnya.Aplikasi ini dapat digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys

Enterprise Platform, 2005). 2.11.4 MarvinSketch

MarvinSketch merupakan aplikasi mendesain gambar struktur yang didirikan oleh ChemAxon, perangkat lunak yang dikembangkan untuk bioteknologi dan farmasetikal industry. MarvinSketch adalah perangkat chemical drawing berbasis Java

yang memungkinkan membuat dan mengedit molekul dalam berbagai format file (DBM et al., 2014).

2.11.5 Autodock

Autodock merupakan sebuah perangkat lunak yang dibangun untuk melakukan suatu prosedur dalam rangka memprediksi interaksi sebuah molekul kecil dari suatu senyawa dengan molekul target.

Hal yang menyebabkan tercetusnya pembuatan software ini adalah karena adanya permasalahan dalam merancang suatu senyawa bioaktif, khususnya dalam hal perancangan obat dengan bantuan komputer (Computer Aided Drug Design). Program ini

bertujuan sebagai alat yang dapat digunakan pada computer untuk membantu proses pembentukan interaksi yang akurat (Yanuar, 2012).

Setiap proses docking dengan AutoDock membutuhkan paling sedikit empat input file, yaitu: PDBQT file untuk ligan; PDBQT file untuk makromolekul atau reseptor; grid parameter file (GPF)

untuk perhitungan oleh AutoGrid; dan docking parameter file

(DPF) untuk perhitungan oleh AutoDock (Yanuar, 2012). 2.11.6 Autodock Vina

AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line.

Untuk hasil input dan output vina, file type yang digunakan

dalah struktur molekul PDBQT seperti yang digunakan pada

software Autodock. Untuk pengaplaksiannya, hanya diperlukan

struktur molekul yang akan di docking dan spesifikasi binding site

2.11.7 Pymol

Pymol adalah program visualisasi molekuler yang diciptakan oleh Warren Lyford DeLano. Pymol memberikan kualitas gambar tiga dimensi yang baik dari molekul kecil dan makromolekul seperti protein.

Pymol merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul (DeLano & Bromberg, 2004).

2.11.8 LigPlot

Program Ligplot secara otomatis menghasilkan skema gambaran 2-D dari interaksi kompleks protein-ligan dari input file standar Protein Data Bank. Hasil Output yang diberikan berupa warna, atau hitam-putih, file PostScript memberikan representasi sederhana dan informatif tentang interaksi antarmolekul dan kekuatan interaksinya, termasuk ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik dan aksesibilitas atom. Program ini sepenuhnya secara umum digunakan untuk ligan apapun dan juga dapat digunakan untuk menunjukkan jenis interaksi protein dan asam nukleat (Wallace et al., 1994).

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan Maret hingga Juni 2015.

3.2. Alat

3.2.1. Perangkat Keras

Notebook Asus (X44C series) dengan spesifikasi Intel®

celeron® CPU (B800 @ 1.50GHz (2 CPUS), ~1.50 GHz), RAM (Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan Graphic Card (Intel®

HD Graphics Family) 784 MB. Notebook terhubung dengan AC/DC adapter dan terkoneksi internet.

3.2.2. Perangkat Lunak

Sistem operasi menggunakan Windows 7 Ultimate 64 bit, Autodock Tools, Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol

(De Lano Scitientific LLC), Marvin Sketch 5.5.1.0

(http://www.chemaxon.com), LigPlot, HyperchemTM trial for Windows, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb), SPSS

3.3. Bahan

3.3.1. Struktur molekul tiga dimensi enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis

Struktur tiga dimensi enzim Inh A diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb. Makromolekul protein yang dipilih adalah enzim Inh A pada Mycobacterium tuberculosis yang didapat dari metode X-ray Diffraction dengan

resolusi 2,70 Å. Identitas makromolekul tersebut adalah 1ENY dengan format .pdb.

3.3.2. Struktur tiga dimensi ligan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat.

Ligan yang digunakan adalah ligan dari senyawa amidasi etil p-metoksisinamat (EPMS) yang dibuat dengan Marvin Sketch

dengan format .mol untuk perhitungan deskriptor dan format .pdb untuk proses docking.

3.3.3 Data anti-tuberculosis beberapa senyawa beserta strukturnya

Data anti-tuberkulosis beberapa senyawa di ambil dari referensi dan jurnal penelitian, kemudian digunakan sebagai

training sets dan test sets untuk membangun persamaan HKSA.

Data aktivitas anti-tuberkulosis yang didapat adalah nilai Minimum Inhibitor Concentration (MIC) dan strukturnya dalam format .mol. 3.4. Cara Kerja

3.4.1. HKSA pendekatan Hansch 3.4.1.1Pemilihan Data Sets

Pemilihan Senyawa Data sets anti-tuberkulosis yang digunakan

melalui pencarian literatur kemudian dibagi menjadi 2 kelompok yaitu senyawa training sets dan test sets. Senyawa training sets

digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Sedangkan senyawa test sets digunakan untuk memvalidasi persamaan HKSA

3.4.1.2Pemilihan deskriptor training sets

Data deskriptor yang digunakan mewakili parameter hidrofobik, elektronik, dan sterik. Untuk parameter hidrofobik digunakan nilai Log D dengan menggunakan aplikasi Marvinsketch. Parameter elektronik yang digunakan adalah energi HOMO, energi LUMO, dan Momen dipol dengan menggunakan aplikasi Hyperchem, perhitungan menggunakan metode semiempiris AM1. Sedangkan parameter sterik yang digunakan adalah Harary index, Randic index, dan Molar refractivity dengan

aplikasi Hyperchem dan Marvinsketch. Training sets yang telah

dipilih kemudian dihitung tiap deskriptornya untuk membangun persamaan HKSA.

3.4.1.3Membangun persamaan HKSA

Persamaan HKSA dibuat melalui perhitungan statistik analisis regresi multilinier dengan program SPSS. Analisa regresi multilinier dilakukan dengan metode backward, yaitu dengan

memasukkan semua variabel bebas (data deskriptor) yang digunakan. Kemudian dicoba penghilangan satu-persatu dalam satu waktu. Persamaan HKSA tersebut merupakan hubungan parameter sifat fisika-kimia yang merupakan variable bebas pada metode Hansch dengan aktivitas anti-tuberkulosis (log 1/MIC) sebagai variable terikat.

3.4.1.4Perhitungan deskriptor test sets

Test set yang telah dipilih dihitung nilai descriptor log D, Energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity menggunakan aplikasi

3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA

Setelah membangun persamaan multilinier regression metode

backward akan didapatkan beberapa model persamaan. Kemudian

diuji validitasnya dengan menghitung nilai r2, Fhit/Ftabel, Standar Error, dan predicted residual sums of squares (PRESS). Persamaan yang diterima harus memenuhi syarat:

1. nilai r2 dari 0,8 hingga 1 2. nilai Fhit/Ftabel > 1

3. nilai SE dan PRESS terkecil atau mendekati 0

Kemudian dihitung nilai Root Mean Standar Deviation

(RMSD) dengan membandingkan nilai Log (1/MIC) eksperimen pada data test sets dengan Log (1/MIC) prediksi test sets dari hasil

model persamaan yang dibuat. Model persamaan yang diterima bila nilai RMSD terkecil atau mendekati 0.

3.4.1.6Prediksi aktivitas sample sets

Senyawa amidasi etil p-metoksisinamat pada format .mol

dihitung nilai deskriptor dengan model persamaan yang telah memenuhi syarat. Nilai deskriptor yang didapat kemudian di masukkan kedalam persaman HKSA untuk mendapatkan prediksi aktivitas anti-tuberkulosis (Log 1/MIC) yang baik.

3.4.2. Penambatan Molekuler

3.4.2.1Penyiapan dan Optimasi Enzim Inh A

Makromolekul enzim InhA diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul pada situs tersebut adalah 1ENY dalam format .pdb.

Makromolekul protein kemudian dilakukan proses pemisahan molekul air dan ligan atau residu non standar. Proses ini dilakukan dengan menggunakan software Discovery Studio 3.5 Visualizer. Hasil makromolekul yang telah dipisahkan disimpan pada dalam format .pdb.

Selanjutnya, dilakukan proses optimasi makromolekul menggunakan software Autodock Tool. Buka software Autodock tool  klik file  read molecul  pilih makromolekul dengan format .pdb. Optimasi meliputi penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter untuk menentukan lokasi

penambatan molekul ligan. Hasil optimasi makromolekul disimpan dalam format .pdbqt.

3.4.2.2Penyiapan dan Optimasi Ligan (senyawa uji)

Ligan yang digunakan sebagai pembanding adalah Isoniazid

yang dapat diunggah melalui PubChem

(http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov). Sedangkan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat yang akan diujikan dibuat struktur tiga

dimensinya dengan software Marvinsketch dan disimpan dalam format .mol, kemudian dikonversi menjadi .pdb dengan program open babel. Optimasi struktur ligan yang telah dibuat dengan menggunakan software Autodock Tools. Dengan cara: Buka ligan yang telah dibuat (ligand → input → open). Kemudian, optimasi pengaturan number of active torsion. Simpan ligan hasil optimasi

(_{ligand → output → save as pdbqt →save)} dalam format .pdbqt.

3.4.2.3Penambatan Molekul dengan Autodock Vina

Langkah awal yang dilakukan adalah mengkopi atau menyimpan data Ligan dan Protein format .pdbqt yang telah dioptimasi kedalam folder Vina. Kemudian buat pengaturan konfigurasi file vina pada notepad dan disimpan dengan format

conf.txt. Selanjutnya, jalankan software Vina melalui Command prompt.

3.4.2.4Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul

Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format

out.pdbqt. Pemilihan hasil penambatan dengan memilih ligan yang memilki nilai energi bebas Gibbs (∆Gbind) terendah. Data nilai

energi ikatan setiap ligan dapat dilihat pada output hasil penambatan ‘log.txt’.

Visualisasi posisi setiap ligan pada makromolekul dan asam amino yang terikat pada ligan dengan menggunakan program Pymol dan Ligplot. Pymol digunakan untuk melihat kecocokan situs tambat pada makromolekul dengan ligan. Pymol akan menvisualisasi secara 3 dimensi, sedangkan ligplot secara 2 dimensi.

Makromolekul yang sebelumnya telah dioptimasi dengan format .pdbqt dan data hasil penambatan output.pdbqt, dibuka menggunakan wordpad. Data dari output.pdbqt disalin kedalam data makromolekul, kemudian disimpan dalam format .pdb dan dilihat interaksi asam amino dan ligannya menggunakan program Ligplot secara dua dimensi.

4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch 4.1.1 Pemilihan data sets

Data sets yang digunakan adalah senyawa turunan asam sinamat

yang memiliki kemiripan dengan senyawa amidasi EPMS dan mempunyai aktivitasi anti-tuberkulosis. Data senyawa turunan sinamat yang digunakan adalah hasil percobaan secara in-vitro yang dilakukan

oleh Guzman et al, (2014) terhadap penghambatan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv atau konsentrasi hambat minimum (MIC). Data senyawa yang digunakan adalah sebanyak 14, kemudian dibagi menjadi 2 bagian, yaitu 9 senyawa sebagai training sets dan 5 senyawa sebagai test sets.

Tabel 4.1 Data sets yang digunakan

No. Nama Senyawa dan Struktur Kode

Senyawa

MIC (μM)

1

ethyl p-methoxycinnamate

S1 485

2

Cinamic acid

S2 270

3

3,4-methylenedioxycinnamic acid

4

3-Coumaric acid

S4 366

5

2-O-prenylcoumaric acid

S6 258

6

4-O-prenylcoumaric acid

S7 86.1

7

4-O-geranylcoumaric acid

S8 66.8

8

Methyl 3-O-Prenylcoumarate

S9 172

9

Methyl 4-O-Prenylcoumarate

S10 81.2

10

Methyl 2-Coumarate

11

Caffeic aldehyde

S13 154

12

2-Coumaric acid

S14 122

13

Methyl 4-Coumarate

S15 224

14

3-O-prenylcoumaric acid

S16 127

Catatan: Untuk mempermudahkan input data, nama senyawa selanjutnya akan digantikan oleh kode senyawa

Tabel 4.2 Data Training sets Tabel 4.3 Data test sets

No. Kode Senyawa MIC No. Kode Senyawa MIC

1 S1 485 1 S4 366

2 S2 270 2 S3 312

3 S6 258 3 S16 172

4 S15 224 4 S14 122

5 S9 172 5 S7 86.1

6 S13 154

7 S12 112

8 S10 81.2

4.1.2 Pemilihan deskriptor Training sets

Deskriptor yang digunakan merupakan hasil dari perhitungan logika matematika yang mengubah informasi yang dikodekan dalam suatu molekul kemudian direpresentasikan kedalam angka-angka yang berguna bagi penelitian berikutnya, baik sebagai pengetahuan tentang molekul tersebut maupun sebagai model untuk mempresiksi molekul lain (Todeschini, 2009).

Sehingga hasil dari deskriptor tersebut dapat mewakili parameter hidrofobik, elektronik, dan sterik pada HKSA model Hansch. Hal ini dikarenakan proses distribusi, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh sifat kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan derajat ionisasi (pKa) sehingga dalam HKSA, parameter yang sering digunakan adalah parameter hidrofobik dan elektronik.Sedangkan untuk proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia, sehingga dalam HKSA, ketiga parameter tersebut ikut dilibatkan, terutama parameter elektronik dan sterik (Siswandono, 2008).

Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter hidrofobik adalah nilai Log D dengan menggunakan program Marvin sketch, Struktur training sets yang telah dibuat dalam aplikasi Marvin sketch

kemudian pilih clean 3D, setelah itu pilih tools  partitioning  logD,

untuk mendapatkan nilai logD.

Untuk deskriptor elektronik yang digunakan adalah nilai energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital), dan momen dipol menggunakan

aplikasi Hyperchem. Setelah struktur training sets dibuat, kemudian

pilih Build  add H and model build. Sebelum dilakukan perhitungan deskriptor, dilakukan optimasi struktur dengan metode semiempiris AM1 dan optimasi geometri.

Pemilihan metode semiempiris AM1, karena metode tersebut sering digunakan dan merupakan metode semiempiris standar untuk perhitungan senyawa organik (Bultink et al., 2004).

Proses optimasi struktur berfungsi untuk mendapatkan struktur yang stabil ketika dilakukan perhitungan parameter elektroniknya, sehingga hasil perhitungan deskriptor yang didapat sesuai dengan sifat-fisika kimia senyawa yang sebenarnya. Proses perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO dengan cara, pilih Compute kemudian pilih Orbitals. Sedangkan untuk momen dipol, pilih Compute  Single Point  Properties.

Kemudian, pemilihan deskriptor yang mewakili parameter sterik adalah Molar refractivity, Harary Index, dan Randic Index. Pehitungan

molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dengan cara, pilih

Compute  QSAR Properties  Refractivity  klik Compute.

Sedangkan untuk Harary Index dan Randic Index menggunakan

aplikasi MarvinSketch. Setelah struktur dibuat dan telah di-clean 3D,

pilih tools GeometryTopological analysispilih Harary Index dan

Randic IndexOk. Semua data kemudian dikumpulkan pada program SPSS dan Microsoft Excel, yang nantinya digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Selanjutnya, aktivitas senyawa yaitu nilai MIC diubah menjadi Log (1/MIC) sebagai variabel tak bebas dan 7 data deskriptor sebagai variabel bebas.

Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training set

No Kode Senyawa

Log

(1/MIC) logD

Energi HOMO Energi LUMO Momen dipol Harary index Randic index Molar refractivity

1 S1 -2.686 2.71 -8.943 -0.639 2.346 39.412 12.815 63.09 2 S2 -2.431 -0.665 -9.471 -0.793 2.679 25.102 8.734 47.2 3 S6 -2.412 0.183 -9.394 -0.615 2.02 47.893 14.695 72.69 4 S15 -2.350 2.207 -9.059 -0.731 3.731 32.25 10.419 53.57 5 S9 -2.236 0.237 -9.215 -0.784 4.055 47.233 14.695 72.69 6 S13 -2.188 1.36 -8.974 -0.847 5.397 29.204 9.272 49.48 7 S12 -2.049 2.205 -9.304 -0.72 1.099 32.639 10.419 53.57 8 S10 -1.91 3.719 -8.922 -0.642 3.029 50.65 15.842 77.46 9 S8 -1.825 1.845 -8.97 -0.71 3.959 66.316 20.222 96.49

4.1.3 Membangun dan validasi Persamaan HKSA

Persamaan HKSA yang dibuat dengan cara analisa regresi multiliner dengan metode backward dibantu oleh program SPSS.

Pemilihan analisa regresi multilinier dikarenakan dalam pembuatan persamaan, parameter-parameter sifat fisika-kimia yaitu data deskriptor yang digunakan lebih dari satu. Sembilan data akitivitas (Log 1/MIC) senyawa training sets dengan masing-masing memiliki 7 data

deskriptor di input pada program SPSS. Kemudian dilakukan analisa

statistic regresi multiliner metode backward dengan cara, pilih analyze RegressionLinier pilih dependent variabel adalah aktivitas

senyawa (Log 1/MIC) dan independent variabel adalah 7 deskriptor

yang digunakanubah method menjadi backwardOk.

Hasil yang didapat dari program SPSS adalah 3 model persamaan HKSA dengan nilai r, r2, Fhitung, SE (Standar Error), dan Deskriptor yang digunakan. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5. Model persamaan yang diterima dalam penelitian HKSA adalah yang memiliki nilai r diantara 0,9 hingga 1, nilai r2 _{antara 0,8 hingga 1, nilai standar}

error (SE) < 1 atau mendekati 0, dan nilai Fhitung lebih kecil dari Ftabel atau Fhit/Ftab>1. Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisa regresi. Sedangkan nilai r2 menunjukkan persentase aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan sifat fisika kimia yang digunakan (Siswandono, 2008; Rifai. et al., 2014).

Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA

Model Deskriptor yang digunakan r r2 SE Fhit Ftab Fhit/Ftab 1 Log D, energi HOMO, energi

LUMO, Momen dipol, Harary Index, Randic Index, Molar

refractivity

0.994 0.988 0.083 12.218 237 0.052

2 Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic

Index, Molar refractivity

0.992 0.985 0.0679 21.179 19.33 1.096 3 Log D, energi HOMO, energi

LUMO , Randic Index, Molar refractivity

Tabel 4.6 Model Persamaan

Keterangan: EH = energi HOMO, EL = energi LUMO, MD = momen dipole, HI = Harary Index, RI = Randic Index, MR = Molar refractivity

Dari hasil analisa yang didapat, model persamaan yang memenuhi syarat adalah persamaan model 2 dan 3. Karena pada persamaan model 1, nilai Fhit/Ftab kurang dari 1 yaitu 0,052. Hal ini dikarenakan nilai F menunjukkan kemungkinan persamaan tersebut adalah suatu hubungan yang bermakna diantara hasil-hasil yang didapat. Jika nilai F perhitungan data percobaan lebih besar dari nilai F tabel maka hasil-hasil percobaan mempunyai hubungan yang besar pada tingkat probabilitas yang diberikan (Siswandono, 2008).

Setelah dilakukan validasi pada data output SPSS dilakukan uji PRESS (prediction sum of squares) dengan menggunakan data aktivitas

senyawa training sets berdasarkan eksperimen (Log 1/MIC eksperimen)

dan data aktivitas senyawa training sets dengan menggunakan model

persamaan yang terpilih ( Log 1/MIC prediksi), yaitu model 2 dan 3. Perhitungan nilai PRESS dengan menggunakan rumus:

Σ{(log 1/MIC eksperimen) – (Log 1/MIC prediksi)}2

Model Bentuk Persamaan

1 log(1/MIC) = -14.130+0.251(logD)-0.693(EH)-3.027(EL)-0.068(MD)+0.044(HI)- _{1.364(RI)+0.294(MR)} 2 log(1/MIC) = -18.7+0.298(logD)-1.22(EH)-2.812(EL)+0.034(HI)-1.106(RI)+0.243(MR) 3 log(1/MIC) = -19.106+0.302(logD)-1.226(EH)-2.828(EL)-1.083(RI)+0.265(MR)

Tabel 4.7 Data Nilai PRESS Kode Senyawa Log(1/MIC) eksperimen Log(1/MIC) prediksi Model 2 Model 3

S1 -2.686 -2.688 -2.676

S2 -2.431 -2.450 -2.404

S6 -2.412 -2.416 -2.446

S15 -2.350 -2.344 -2.354

S9 -2.236 -2.166 -2.172

S13 -2.188 -2.203 -2.227

S12 -2.049 -2.064 -2.085

S10 -1.910 -1.878 -1.859

S8 -1.825 -1.874 -1.874

Nilai PRESS 0.009 0.014

Dari tabel 4.7 diketahui nilai PRESS yang terkecil atau mendekati 0 adalah model 2 yaitu 0,009. Nilai PRESS yang kecil menandakan aktivitas prediksi dari suatu persamaan HKSA mendekati aktivitas eksperimen. Untuk memvalidasi lagi model persamaan yang terpilih, maka dilakukan uji diluar data senyawa pembuat persamaan HKSA yaitu pada data test sets.

Sebanyak 5 data tes sets yang digunakan dihitung data deskriptor

terpilih dari persamaan model 2 dan 3, yaitu; Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic Index, dan Molar refractivity.

Setelah semua data deskriptor terkumpul, maka dilakukan perhitungan aktivitas yaitu nilai Log 1/MIC prediksi senyawa tes set menggunakan persamaan model 2 dan 3 untuk mendapat nilai RMSD (root mean square deviation) terkecil, dengan membandingkannya pada

Log 1/MIC eksperimen senyawa tes set. Perhitungan RMSD dengan rumus:

Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set Kode

Senyawa log(1/MIC) logD

Energi HOMO Energi LUMO Harary Index Randic Index Molar Refractivity

S4 -2.563 -1.322 -9.323 -0.889 28.921 9.272 48.8 S3 -2.494 -1.77 -9.086 -0.947 38.024 10.103 52.79 S16 -2.236 -0.19 -9.172 -0.816 47.233 14.695 72.69 S14 -2.086 -1.309 -9.316 -0.942 29.136 9.272 48.8

S7 -1.935 0.186 -8.973 -0.713 46.751 14.695 72.69

Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set Kode

Senyawa

Log(1/MIC) eksperimen

Log(1/MIC) prediksi Model 2 Model 3

S4 -2.563 -2.633 -2.671

S3 -2.494 -2.533 -2.775

S16 -2.236 -2.255 -2.263

S14 -2.086 -2.481 -2.526

S7 -1.935 -2.692 -2.684

Nilai RMSD 0.384 0.411

Dari hasil RMSD dapat diketahui bahwa model persamaan dengan nilai RMSD kecil adalah model persamaan 2, hal ini sesuai dengan hasil uji PRESS, dimana model persamaan 2 memiliki nilai PRESS terkecil. Sehingga dapat disimpulkan dari hasil validasi model persamaan, persamaan 2 telah memenuhi syarat pemodelan persamaan HKSA.

Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) - 1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity)

(r = 0.992; r2 _{= 0.98; SE = 0.0679; Fhit/Ftab = 1.096)}

Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa semakin besar nilai deskriptor log D, Harary index, dan Molar refractivity akan

meningkatkan aktivitas anti tuberkulosis. Sedangkan semakin kecil nilai deskriptor energi HOMO, energi LUMO, dan Randic Index akan

meningkatkan aktivitas anti tuberculosis. Hal ini dikarenakan koefisien pada setiap deskriptor mempengaruhi nilai aktivitas suatu senyawa.

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets

Sampel yang digunakan yaitu 11 senyawa amidasi EPMS dan EPHS (etil p-hidroksisinamat) dibuat bentuk strukturnya dan dihitung

nilai deskriptor terpilih pada persamaan HKSA kedua. Senyawa yang diujikan merupakan senyawa yang dimungkinkan dapat disintesis, sehingga nantinya dapat dilakukan uji in-vitro aktivitas

anti-tuberkulosis pada senyawa tersebut. R² = 0.9843

-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0

Log (1/MIC) eksperimen

Log (1/MIC) prediksi

Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC) prediksi dengan model persamaan HKSA 2 pada 9 senyawa training sets.

Sebelum melakukan proses perhitungan deskriptor pada Hyperchem maupun Marvinsketch, dilakukan optimasi yang sama seperti perhitungan deskriptor pada training sets dan test sets, yaitu

menggunakan metode semiempirik AM1 pada Hyperchem dan dilakukan clean 3D pada marvin sketch. Setelah semua data deskriptor

di dapat, dengan menggunakan Microsoft excel semua data direkapitulasi dan dilakukan perhitungan MIC prediksi senyawa sampel.

Tabel 4.10 Data sample sets No. Kode

Senyawa

Nama IUPAC Struktur

1 Amida_1 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

2 Amida_2 (2E)-N-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

3 Amida_3 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop-2-enamide

4 Amida_4 (2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylprop-2-enamide

5 Amida_5 (2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

6 Amida_6 (2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

7 Amida_7 (2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

8 Amida_8 (2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

9 Amida_9 (2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

10 Amida_10 ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2-enoate

11 Amida_11 (2E)-N,N-dibenzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

12 EPHS ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate

Catatan: Untuk mempermudah analisa data, nama senyawa IUPAC diganti dengan kode senyawa

Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets

No. Kode

Senyawa Log D

Energi HOMO Energi LUMO Harary Index Randic Index Molar Refractivity 1 Amida_1 1.171 -8.866 -0.484 32.302 10.791 55.4 2 Amida_2 1.165 -9.01 -0.737 35.874 11.329 56.87 3 Amida_3 1.395 -8.842 -0.468 35.874 12.003 60.29 4 Amida_4 1.619 -8.862 -0.505 39.946 13.214 65.19 5 Amida_5 0.815 -8.942 -0.544 39.412 12.563 61.39 6 Amida_6 0.459 -9.022 -0.546 47.938 14.335 67.39 7 Amida_7 0.705 -8.862 -0.491 42.951 13.813 66.58 8 Amida_8 0.239 -8.891 -0.472 56.083 16.835 77.77 9 Amida_9 3.12 -8.874 -0.279 60.358 16.678 89.04 10 Amida_10 2.043 -8.527 -0.528 35.697 12.041 60.27 11 Amida_11 5.068 -8.673 -0.204 97.07 22.565 122.69 12 EPHS 2.564 -9.039 -0.698 35.697 11.669 58.32

3.7 Penambatan molekul dengan Autodock vina

Proses penambatan molekul dimulai dengan menyalin data ligan.pdbqt dan makromolekul 1ENY.pdbqt yang telah di optimasi pada folder vina di Local Disc (C:). Kemudian ditambah data config file (conf.txt) dengan notepad, pengaturan conf.txt sesuai

pengaturan gridbox parameter

3.8

Proses penambatan dengan menggunakan Command prompt

Masuk kedalam folder vinacd “C:\vina” enterketik: vina -–config conf.txt -–log log.txtenter.

Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya

1. Isoniazid

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

2. Amida_11

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

3.

Amida_9

4.

Amida_2

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

5.

Amida_7

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

6.

Amida_5

7.

Amida_3

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

8.

Amida_1

Ligplot

Pymol

9.

Amida_4

10.

Amida_8

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

11.

Amida_6

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

12.

Amida_10

13.

EPHS

Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

Keterangan: C=hitam, O=Merah, N=biru, ikatan hidrogen=garis hijau, dan ikatan hidrofobik= garis merah menyerupai alis

Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru, H=putih, P=jingga