Penambatan molekuler .1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 4.2 Penambatan molekuler 4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A Dalam proses penambatan molekul, hal yang harus disiapkan adalah makromolekul dan ligan yang akan ditambatkan, kemudian dilakukan optimasi terhadap makromolekul dan ligan tersebut. Penyiapan makromolekul pada penelitian ini adalah dengan cara mengunduh makromolekul enzim Inh A dalam 3D pada Protein Data Bank http:www.rcsb.org. Enzim Inh A yang di unduh dengan format .pdb adalah makromolekul dengan kode 1ENY dan merupakan enzim Inh A pada Mycobacterium tuberculosis yang diperoleh dari kristalografi sinar X dengan resolusi 2,20 Å. Pemilihan kode 1ENY mengacu pada penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Cohen et a.,2011, tentang penambatan molekul pada enzim Inh A. Enzim Inh A yang telah diunduh kemudian dilakukan optimasi makromolekul. Optimasi bertujuan untuk menghilangkan molekul non standar dan menargetkan ruang tambat ligan pada makromolekul. Molekul non standar seperti ligan dan molekul air yang ikut terunduh dihilangkan dengan menggunakan program Discovery studio, dengan cara, Pilih Script  Selection  Select water molecul dan ligan  delete . Dengan menghilangkan molekul air dan ligan, makromolekul nantinya akan tepat menambat pada senyawa uji ligan sampel. Enzim Inh A yang telah teroptimasi dengan menggunakan program Discovery studio kemudian di simpan dalam format .pdb. Optimasi kedua yang dilakukan adalah penambahan atom hidrogen dan penentuan grid box parameter menggunakan program Autodock tools. Penambahan atom hidrogen penting untuk interaksi ligan dan reseptor. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar, karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen Yanuar, 2012. Proses penambahan atom hidrogen adalah, pilih Edit  Hydrogen  Add  Ok . Setelah dilakukan penambahan atom hidrogen, dilakukan optimasi grid box parameter . Optimasi grid box parameter berfungsi untuk membuat peta tiga dimensi interaksi protein dengan setiap jenis atom yang terdapat pada ligan Yanuar, 2012. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Peta tiga dimensi tersebut merupakan ruang tambat antara makromolekul dan ligan. Penentuan grid box parameter bisa melalui pencarian literatur atau melihat ruang tambat ligan yang berasal dari makromolekul itu sendiri. Pada penelitian ini grid box parameter mengikuti penelitian yang dilakukan oleh Cohen et al., 2011. Pengaturan pada grid box meliputi center_x, center_y, center_z, untuk mengatur letak parameter box pada makromolekul. Kemudian size_x, size_y, size_z, dan spacing angstrom, untuk menentukan ukuran grid box sebagai ruang tambat ligan tersebut. Hasil pengaturan grid box yang diperoleh adalah center_x = -3.609, center_y = 37.853 center_z = 18.312, size_x = 37, size_y = 22, size_z = 22, dan spacing angstrom = 0,375. Cara pengaturan grid box adalah dengan pilih Gridgrid boxatur grid box parameter yang adafileclose saving current. Setelah semua optimasi selesai, makromolekul tersebut di simpan dalam format .pdbqt, untuk selanjutnya akan dilakukan proses penambatan molekul dengan program autodock vina.

4.2.3 Penyiapan dan optimasi ligan senyawa uji

Ligan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 senyawa amidasi etil p-metoksi sinamat dengan kontrol positifnya adalah isoniazid. Senyawa yang digunakan dianggap sebagai bukan pro-drug, sehingga tidak berikatan dengan NADH untuk berinteraksi dengan enzim Inh A. Hal ini dikarenakan belum diketahui secara langsung bagaimana proses senyawa amidasi EPMS berinteraksi dengan enzim Inh A. Sedangkan telah diketahui, suatu senyawa yang berinteraksi dengan enzim Inh A tidak selalu berikatan dengan NADH. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking No. Nama Senyawa IUPAC Kode Senyawa 1 2E-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide Amida_1 2 2E-N-hydroxy-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide Amida_2 3 2E-3-4-methoxyphenyl-N-methylprop-2-enamide Amida_3 4 2E-3-4-methoxyphenyl-N,N-dimethylprop-2-enamide Amida_4 5 2E-N-hydroxymethyl-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide Amida_5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 6 2E-N,N-bishydroxymethyl-3-4-methoxyphenylprop-2- enamide Amida_6 7 2E-N-2-hydroxyethyl-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide Amida_7 8 2E-N,N-bis2-hydroxyethyl-3-4-methoxyphenylprop-2- enamide Amida_8 9 2E-N-benzyl-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide Amida_9 10 ethyl 2E-3-4-aminophenylprop-2-enoate Amida_10 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 11 2E-N,N-dibenzyl-3-4-methoxyphenylprop-2-enamide amida_11 12 ethyl 2E-3-4-hydroxyphenylprop-2-enoate EPHS 13 Isoniazid INH Senyawa tersebut dibuat dengan menggunakan aplikasi Marvin sketch, setelah proses pembuatan selesai, struktur yang dibuat kemudian dilakukan clean 3D, dengan cara, pilih structure pilih cleaning method fine with hydrogenize clean in 3D. Struktur kemudian disimpan dalam format .mol. Untuk bisa dilakukan optimasi ligan dengan menggunakan program autodocktools, maka dilakukan perubahan format .mol menjadi .pdb dengan menggunakan program open babel. Struktur dengan format .pdb kemudian dioptimasi number of active torsion -nya. Proses ini berfungsi untuk menentukan ikatan-ikatan aktif pada ligan yang dapat diputar selama proses docking berlangsung. Proses pengoptimasian dengan cara, pilih ligandtorsion treeset number of torsiondismiss . Kemudian di simpan dalam format .pdbqt, dengan cara pilih ligand outputsave as pdbqt. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.2.4 Penambatan molekul dengan Autodockvina

Setelah data makromolekul dan ligan selesai di optimasi dan di ubah format file menjadi .pdbqt. Kedua data tersebut kemudian di pindahkan ke dalam folder vina yang terdapat pada local disc C:. Dalam folder vina kemudian juga ditambahkan file konfigurasi menggunakan notepad, proses konfigurasi dapat dilihat pada lampiran 3. Data konfigurasi pada notepad, meliputi reseptor yang merupakan makromolekul yang digunakan yaitu 1ENY.pdbqt dan ligan yang merupakan senyawa uji dengan format .pdbqt. Selanjutnya data out.pdbqt merupakan hasil dari visualisasi docking ligan pada makromolekul dan log.txt merupakan nilai energi bebas ΔG bind yang akan keluar setelah proses docking selesai. Dan terakhir adalah data center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z yang merupakan grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya. File konfigurasi ini disimpan dengan nama ‘conf.txt. ’ Setelah semua data yang ada difolder vina sudah lengkap, yaitu 1ENY.pdbqt, Ligand.pdbqt, dan conf.txt, maka proses docking dapat dimulai. Proses docking dijalankan dengan program Command Prompt. Melalui Command Prompt, masuk kedalam folder vina kemudian dilakukan perintah dengan mengetik: Vina --config conf.txt --log log.txt Proses docking pada penelitian ini berjalan selama 2-5 menit, kecepatan dari proses docking dipengaruhi oleh spesifikasi computer dan bentuk ligan yang ditambatkan. Semakin tinggi spesifikasi atau semakin sederhana bentuk ligan, maka semakin cepat proses docking berlangsung. Setelah proses docking selesai, akan muncul data baru pada folder vina, yaitu log.txt dan out.pdbqt. Data log.txt memberikan hasil nilai afinitasenergi bebas ΔG bind dan RMSD dari hasil docking. Sedangkan data out.pdbqt merupakan bentuk hasil konformasi ligan dengan ruang tambatnya pada makromolekul. Data tersebut dapat divisualisasi dengan program autodock tools, Pymol, dan Ligplot, untuk dilihat interaksi ligan dengan asam amino pada makromolekul. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.2.5 Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekuler

Hasil yang didapat dari proses penambatan molekuler adalah nilai ΔG bind dan RMSD, serta visualisasi interaksi ligan dengan asam amino pada enzim Inh A. Nilai ΔG bind merupakan energi konformasi hasil docking antara ligan dan makromolekul, energi konformasi tersebut merupakan kontribusi dari ikatan van der waal, hidrofobik, ikatan hidrogen dari atom-atom netral, ikatan hidrogen atom-atom bermuatan, dan jumlah ikatan berotasi Adelin et al., 2013 . Sedangkan RMSD root mean square deviation , merupakan nilai validasi dari hasil ΔG bind , semakin kecil nilai RMSD maka konformasi yang terbentuk semakin baik, sehingga nilai RMSD yang diambil adalah mendekati atau sama dengan 0. Interaksi ligan dan asam-asam amino pada enzim Inh A yang terlihat melalui progam ligplot adalah adanya ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik secara 2 dimensi, sedangkan pada program Pymol visualisasi yang terlihat adalah tempat penambatan ligan pada makromolekulnya yang disebut dengan binding pocket secara 3 dimensi. Proses visualisasi pada Ligplot adalah dengan cara membuka file ligan hasil docking dan makromolekul dengan format .pdb, dengan cara, filepdb filecari file yang akan divisualisasiOkRun. Kemudian, visualisasi pada pymol dengan cara membuka file ligan out.pdbqt dan makromolekul 1ENY.pdbqt. Prosesnya dengan cara pilih openpilih file out.pbqt dan 1ENY.pdbqtok, dan untuk melihat daerah binding pocket ligan dengan makromolekul dengan cara all actionpresetligand sitepilih tampilan yang diinginkan misalkan, solid betterklik kiri. Hasil visualisasi dengan program Ligplot dan Pymol dapat dilihat pada Lampiran 4. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Tabel 4.14 Hasil Penambatan molekuler Struktur ∆G bind Jenis asam amino Ikatan Hidrogen Ikatan Hidrofobik Amida_11 -9.4 Gly96 Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16 Amida_9 -8.4 Thr39 Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130 Amida_2 -7.2 Thr39, Gly14 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 Amida_7 -7.1 Gly14, Ala22, Ser94 Phe41, Val65, Gly96, Ile16, Ser20, Ile21, Ile95, Asp64 Amida_5 -6.9 Ile21, Ala22, ser94 Asp64, Ile95, Gly96, Ile16, Ser20, Gly14, Phe41 Amida_3 -6.7 Thr39 Leu63, Val65, Phe41, Phe97, Gly96, Ile95, Ser13, Gly14, Met130 Amida_1 -6.6 Thr39, Gly14 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 Amida_4 -6.6 Thr39 Ser13, Gly14, Leu63, Phe41, Ile16, Ile95, Val65, Met130 Amida_8 -6.5 Gly14, Ala22, Ser94 Ile95, Ile122, Gly96, Ile16, Ser20, Thr196, Ile21, Phe41, Val65 Amida_6 -6.4 Gly14, Ala22, Ser94, Ile21, Gly96 Ile16, Phe41, Ile95, Ser20, Ile15, Asp42 Amida_10 -6.1 Thr39 Ile95, Leu63, Phe41, Phe97, Gly14, Val65 EPHS -6.1 Thr39 Gly14, Phe41, Phe97, Val65, Ile95, Leu63 Isoniazid -6 Thr39, Gly14 Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65 Dari tabel 4.14 nilai ∆G bind tiga senyawa terkecil adalah senyawa dengan kode Amida_11, Amida_9, dan Amida_2, dengan nilai energi -9,4 kcalmol, -8,4 kcalmol, dan -7,2 kcalmol. Nilai ∆G bind kecil menandakan bahwa konformasi yang terbentuk antara ligan dengan makromolekul merupakan kompleks yang stabil. Selain itu, bisa dilihat bahwa isoniazid yang merupakan kontrol positif pada docking memilki nilai ∆G bind besar yaitu -6, hal ini membuktikan bahwa isoniazid memang harus berikatan dengan NADH untuk membentuk konformasi yang stabil dengan enzim Inh A. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Senyawa Visualisasi Ligplot Visualisasi Pymol INH Amida_11 Amida_9 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Amida_2 Keterangan: C=hitam, O=Merah, N=biru, ikatan hidrogen=garis hijau, dan ikatan hidrofobik= garis merah menyerupai alis Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru, H=putih, P=jingga Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan Isoniazid dan 3 senyawa uji dengan ∆G bind terendah Dilihat dari residu asam amino yang berinteraksi, isoniazid berikatan hidrogen dengan Thr39 dan Gly14, sedangkan untuk yang berikatan hidrofobik adalah dengan asam amino Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65. Selanjutnya pada 3 senyawa dengan ∆G bind terendah. Amida_11 dan Amida_9 memilki jumlah residu asam amino yang sama yaitu 13 asam amino dan lebih banyak dari amida_2. Amida_11 berikatan hidrogen dengan Gly96, dan berikatan hidrofobik dengan Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16. Amida_9 berikatan hidrogen dengan Thr39, dan berikatan hidrofobik dengan Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130. Sedangkan pada Amida_2 hanya berikatan dengan 8 asam amino, yaitu Thr39 dan Gly14 yang berikatan hidrogen, serta Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 yang berikatan hidrofobik. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Ikatan hidrogen merupakan ikatan antara atom H yang mempunyai muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan dan mempunyai sepasang oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Adanya ikatan hidrogen dapat mempengaruhi sifat fisika kimia obat, sehingga berperan penting terhadap aktivitas biologis obat. Sedangkan ikatan hidrofobik adalah ikatan yang menggambungkan daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar pada reseptor biologis Siswando, 2008. Oleh karena itu, ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik mempengaruhi kestabilan konformasi yang terjadi antara ligan dan makromolekul. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Eghdami, et al 2015 tentang target ikatan isoniazid dengan enzim Inh A, menyatakan bahwa situs aktivitas enzim Inh A, dicirikan dengan adanya 5 asam amino, yaitu G1y14, Thr39, Phe41, Leu63 and Ile95. Berdasarkan hal tersebut, Senyawa dengan nilai ∆G bind terendah yaitu amida_11 telah tepat menambat pada binding pocket enzim Inh A untuk memberikan aktivitas anti-tuberkulosis. Tabel 4.15 Perbanding ∆G bind dan MIC prediksi No. Struktur Penambatan molekuler HKSA ∆G bind Kcalmol MIC prediksi μM 1 Amida_11 -9.4 0.008 2 Amida_9 -8.4 8.249 3 Amida_2 -7.2 601.082 4 Amida_7 -7.1 8619.5 5 Amida_5 -6.9 4519.21 6 Amida_3 -6.7 3856.26 7 Amida_1 -6.6 3530.95 8 Amida_4 -6.6 2518.77 9 Amida_8 -6.5 18581.1 10 Amida_6 -6.4 7410.95 11 Amida_10 -6.1 4587.2 12 EPHS -6.1 292.434 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Dari tabel 4.15 terlihat bahwa senyawa dengan kode amida_11 selain memiliki nilai ∆G bind terendah -9,4 Kcalmol, juga memiliki MIC prediksi terkecil yaitu 0,008 μM. Diketahui bahwa MIC Isoniazid yang merupakan pengobatan lini pertama tuberkulosis adalah 0,03 –0,06 μgml Zhang et al, 2005, bila dikonversikan dalam satuan molar yaitu membagi dengan berat molekulnya 137,14 gmol Depkes, 1995, maka didapat MIC isoniazid adalah 0,219- 0,438 μM. Berdasarkan hal tersebut, nilai MIC prediksi amida_11 memiliki aktivitas sekitar 100 kali lebih baik dari isoniazid. Walaupun MIC prediksi amida_11 lebih kecil dari isoniazid, nilai tersebut hanya didapat dari perhitungan aktivitas senyawa yang dibandingkan dengan sifat fisika-kimianya, sehingga perlu dilakukan uji selanjutnya, seperti uji in-vitro senyawa dengan kode amida_11 pada Mycobacterium tuberculosis langsung. Karena tujuan dari penggunaan model HKSA adalah proses awal dalam rancangan obat dalam usaha mendapatkan suatu obat baru dengan aktivitas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar, dengan biaya yang lebih ekonomis, waktu yang lebih singkat, dan dapat menekan faktor coba- coba sekecil mungkin dalam sintesis kandidat senyawa uji, sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek Siswandono, 2008. 63 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN