titrimetri atau sering disebut metode Karl Fischer Titration didasarkan pada reaksi secara kuantitatif air dengan larutan anhidrat belerang dioksida dan iodin dengan
adanya dapar yang bereaksi dengan ion hidrogen Huynh-Ba, 2009.
F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
1. Definisi
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT atau biasa disebut dengan HPLC High Performance Liquid Chromatography merupakan teknik
pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain farmasi
lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk
analisis kualitatif maupun kuantitatif Gandjar dan Rohman, 2007. Tujuan analisis menggunakan KCKT adalah memisahkan analit dari komponen lain
dalam matriks sampel dan mendapatkan kuantifikasi yang akurat untuk setiap analit Ahuja dan Dong, 2005.
Sistem KCKT akan membawa sampel masuk ke dalam kolom oleh fase gerak. Proses pemisahan komponen dalam sampel terjadi karena adanya
interaksi yang berbeda antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam yang berada di dalam kolom Harvey, 2000. Salah satu metode
pemisahan dari KCKT yang biasanya menjadi pilihan pertama untuk pemisahan dua senyawa dalam matriks sampel adalah sistem KCKT fase
terbalik di mana pada sistem ini fase diam yang digunakan memiliki sifat kurang polar jika dibandingkan dengan fase geraknya. Fase diam yang sering
digunakan adalah C
8
atau C
18
, sedangkan fase gerak yang sering digunakan dalam sistem ini adalah campuran air dengan asetonitril ACN atau metanol
MeOH. Dibandingkan dengan KCKT lain fase normal, penukar ion, dan lainnya, kromatografi fase terbalik biasanya lebih mudah, tahan, dan dapat
digunakan secara luas. Kolom yang digunakan pada kromatografi fase terbalik juga lebih efisien dan reprodusibel Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010.
2. Instrumentasi
Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk
memasukkan sampel, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan suatu perangkat komputer atau integrator atau
perekam Gandjar dan Rohman, 2007. Skema instrumen KCKT terlihat pada gambar 2.
Gambar 2. Skema instrumen KCKT Ahuja dan Dong, 2005
a. Wadah fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam inert.
Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Sebelum digunakan, fase gerak harus di-degassing
terlebih dahulu untuk menghilangkan gelembung gas yang ada. Adanya gas
akan berkumpul menjadi komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak juga harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari adanya partikel-partikel kecil. Partikel kecil ini dapat terkumpul dalam kolom atau dalam tabung yang sempit,
sehingga dapat mengakibatkan kekosongan pada kolom atau tabung tersebut Gandjar dan Rohman, 2007.
b. Pompa. Pompa yang digunakan dalam KCKT harus inert terhadap fase
gerak yang digunakan dan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi serta mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3
mLmenit. Bahan yang sering digunakan untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Tujuan penggunaan pompa adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan Gandjar dan Rohman,
2007. c.
Tempat penyuntikan sampel injector. Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah
tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
sample loop internal atau eksternal. Proses penyuntikan dilakukan dengan memutar katup sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan
mengalir sampai ke kolom. Kelebihan sampel akan dikeluarkan ke wadah pembuangan Gandjar dan Rohman, 2007. Seiring perkembangan jaman,
tempat penyuntikan sampel berkembang menjadi sistem autosamplers.
Sistem ini memudahkan pengguna KCKT untuk mengatur volume yang akan diinjeksikan berdasarkan program yang ada. Sampel dimasukkan ke
dalam vial, kemudian diletakkan pada rak autosamplers Kazakevich dan LoBrutto, 2007.
d. Kolom. Ada dua jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan
kolom mikrobor. Kolom pada KCKT biasanya berisi fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi atau
polimer-polimer stiren, dan divinil benzene. Oktadesil silika ODS atau C
18
merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi Gandjar dan Rohman, 2007. Proses pemisahan antar komponen dalam sampel terjadi pada kolom KCKT. Pemisahan terjadi
berdasarkan interaksi antara komponen dalam sampel dengan fase gerak dan fase diam. Komponen sampel yang bersifat polar akan terelusi lebih dahulu
dan komponen dalam sampel yang bersifat nonpolar akan terelusi lebih lama dari kolom KCKT fase terbalik. Hal ini disebabkan interaksi antara
komponen polar dalam sampel dengan fase diam lemah sehingga lebih terbawa fase gerak, sedangkan interaksi antara komponen nonpolar dalam
sampel dengan fase diam lebih kuat sehingga lebih sukar terbawa fase gerak Snyder dkk., 2010.
e. Detektor. Detektor yang paling banyak digunakan untuk analisis di bidang
farmasi adalah detektor ultraviolet-visibel UV-Vis karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Gandjar dan Rohman, 2007. Idealnya suatu detektor yang digunakan dalam sistem KCKT harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel, mempunyai sensitifitas yang tinggi mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat
kecil, stabil dalam pengoperasiannya, mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita, sinyal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas, dan tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak Gandjar dan
Rohman, 2007. f.
Data sistem. Alat pengumpul data seperti komputer, integrator, atau rekorder dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal
elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis
pengguna Gandjar dan Rohman, 2007.
G. Validasi Metode Analisis
