Waktu dan Tempat Pengamatan Analisis Data

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Mikropropagasi Tanaman Balai Pengkajian Bioteknologi Balai Pengkajian dan Penerapan Teknologi BPPT Serpong. Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2008 sampai Januari 2009.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi laminar air flow cabinet, lemari es, autoclave, microwave, timbangan analitik, pH meter, shaker, tabung kultur dan rak kultur, gelas piala, labu ukur, corong glass, pengaduk magnetik, plastik wrap, micropipet, pipet, aluminium foil, gunting taman, tabung, timer, gunting, cawan petri, sprayer, pinset, tissu steril, dan pisau scalpel, serta alat-alat lain yang biasa digunakan. Untuk mengetahui kondisi ruang kultur terdapat alat pengontrol suhu dan kelembaban.

3.2.2 Bahan

3.2.2.1 Media

Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS Murashige dan Skoog sesuai dengan komposisi pada lampiran 2, sedangkan untuk media perlakuan ditambahkan zat pengatur tumbuh berupa AdSO 4, BAP, kinetin dan thidiazuron dengan taraf konsentrasi 0,50; 1,00; 1,50 dan 2,00 mgl. Media dasar yang dibuat dalam bentuk padat dengan penambahan pemadat agar-agar.

3.2.2.2 Eksplan

Bahan Eksplan yang digunakan adalah ruas batang tanaman binahong Anredera cordifolia [Ten.] Steenis yang diperoleh dari koleksi Balai Pengkajian Bioteknologi BPPT Serpong yang berasal dari Sumedang.

3.2.2.3 Sterilisasi

Bahan-bahan sterilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah larutan Benzalkonium chloride 1,5 , larutan bakterisida dan fungisida, betadine, larutan clorok 10 dan 5, larutan alkohol 70 dan 96, serta air steril.

3.3 Metode Kerja

3.3.1 Sterilisasi

3.3.1.1 Sterilisasi Alat-alat dan Media Kultur

Alat-alat yang digunakan dalam penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam pinset, gunting, scalpel, dll, gelas petridish, tabung kultur, pipet, dll disterilkan dengan autoklaf pada temperatur 121 o C dan tekanan 17,5 psi selama 30 menit. Pada saat proses penanaman alat-alat tanam dicelupkan ke dalam alkohol 96, kemudian bakar di atas api. Proses sterilisasi media kultur dilakukan dengan autoclave pada tekanan 17,5 psi dan suhu 121 o C selama 15 menit. Sterilisasi air steril dapat dilakukan dengan tekanan, suhu dan waktu yang sama dengan sterilisasi alat.

3.3.1.2 Sterilisasi Eksplan

Bahan tanaman eksplan disterilisasi sebelum ditanam. Sterilisasi dilakukan sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan di laboratorium mikropropagasi tanaman biotek dengan memberikan empat perlakuan tambahan yang dilakukan sebelum proses sterilisasi tersebut yaitu sterilisasi I tidak menggunakan betadine dan alkohol, sterilisasi II betadine 2 tetes, sterilisasi III alkohol 70, dan sterilisasi IV alkohol 96 yang diuraikan pada tabel 2. Tabel 2 Pemberian perlakuan sterilisasi pada eksplan binahong Perlakuan Penambahan bahan sterilan Sterilisasi sesuai prosedur di biotek I Kontrol tidak menggunakan betadine dan alkohol Benzalkonium chloride 1,5 selama 15 menit, dikocok perlahan. eksplan dibilas dengan air mengalir selama 30 menit kemudian dimasukkan ke dalam larutan fungisida dan bakterisida selama 1 jam dikocok dengan menggunakan shaker. Tahapan berikutnya sterilisasi dilakukan di dalam laminar air flow cabinet terdiri dari perendaman dan pengocokan eksplan dalam alkohol 70 selama 3 menit, larutan clorok 10 selama 10 menit II Larutan betadine 2 tetes liter Lanjutan tabel 2 Pemberian perlakuan sterilisasi pada eksplan binahong III Alkohol 70 dan larutan clorok 5 selama 5 menit. Setiap proses pergantian larutan, bahan eksplan dibilas dengan menggunakan air steril sebanyak tiga kali. Kemudian keringkan dengan tissu steril dan tanam pada media MS. IV Alkohol 96

3.3.2 Pembuatan Media

3.3.2.1 Pembuatan Larutan Stok

Larutan stok yang akan dibuat berdasarkan pengelompokannya terdiri dari stok makro, stok mikro, stok Fe-EDTA, stok vitamin dan stok hormon. Pembuatan larutan stok bertujuan untuk menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Komposisi larutan stok yang digunakan disajikan pada lampiran 2. Unsur hara yang telah ditimbang sesuai dengan berat yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dalam air steril atau aquades 1 liter. Larutan stok yang telah selesai dibuat, sebaiknya disimpan di tempat yang bertemperatur rendah dan gelap.

3.3.2.2 Pembuatan Media MS

Pembuatan media dengan larutan stok dilakukan dengan metode pengenceran. Pengambilan setiap larutan stok yang dibutuhkan untuk pembuatan media MS sebanyak 1 liter dapat dilihat pada lampiran 2. Penambahan gula pasir sebanyak 30 gl hendaknya dilakukan sebelum pengenceran, sehingga volume akhir yang akan dibuat tepat. Komposisi media yang sudah lengkap kemudian dilarutkan dan diencerkan dengan menggunakan air aquades hingga mencapai volume akhir 1 liter.

3.3.2.3 Pembuatan Media Perlakuan

Untuk merangsang multiplikasi tunas dan pertumbuhan eksplan, ke dalam larutan media MS ditambah sitokinin tunggal berupa AdSO 4, BAP, kinetin dan thidiazuron dengan taraf konsentrasi sebagai berikut 0,50 mgl; 1,00 mgl; 1,50 mgl dan 2,0 mgl. Penambahan beberapa jenis sitokinin tersebut dilakukan sebelum pengukuran pH yang berkisar antara 5,8. Apabila pH 5,8 dapat ditambahkan HCl, sedangkan jika pH 5,8 dapat NaOH. Tambahkan agar-agar 8 gl ke dalam larutan dan selanjutnya diaduk menggunakan magnetik stirer. Larutan tersebut ditutup dengan menggunakan plastik wrap yang diberi lubang untuk proses pemasakan menggunakan microwave. Media perlakuan yang telah mendidih, dituang ke dalam tabung kultur ± 10 mltabung untuk seluruh perlakuan, kemudian ditutup dan disterilisasi menggunakan autoclave dengan temperatur 121 o C dan tekanan 17,5 psi selama 15 menit.

3.3.3 Penanaman

3.3.3.1 Sub kultur

Eksplan-eksplan yang steril dan tumbuh disubkultur dalam media MS baru yaitu dengan cara memindahkan dan memisahkan batang dengan tunas yang telah terbentuk.

3.3.3.2 Perlakuan hormon

Penaman dilakukan dengan cara memotong-motong planlet yang tumbuh pada media MS dipindahkan pada media perlakuan.

3.4 Pengamatan

Pengamatan dilakukan 8 minggu tanpa mengeluarkan tanaman dari tabung kultur. Parameter yang diamati meliputi: 1. Jumlah tunas Jumlah tunas yang baru terbentuk merupakan parameter paling penting dalam menentukan keberhasilan multiplikasi. Tunas yang dihitung adalah tunas adventif yang muncul pada bagian pangkal eksplan yang telah membentuk kalus dan tunas lateral yang terdapat pada bagian ketiak daun. 2. Jumlah daun Jumlah daun yang dihitung adalah daun yang terbentuk pada batang eskplan awal dan membuka sempurna. 3. Pertambahan tinggi Tinggi diukur dari pangkal eksplan awal sampai ujung petiola daun tertinggi. 4. Jumlah akar Akar yang dihitung adalah akar yang terdapat pada buku dan pangkal eksplan awal. 5. Penampakan visual tanaman yang terbentuk setiap eksplan berupa perubahan warna, kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning atau pencoklatan, kematian dan pembentukan kalus.

3.5 Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan statistik. Analisis data deskriptif yang didapatkan dari hasil pengamatan secara visual yang terjadi pada eksplan binahong seperti kontaminasi oleh jamur dan bakteri, browning atau pencoklatan, tingkat kematian eksplan dan pengkalusan. Eksplan yang dideskripsikan meliputi keseluruhan eksplan binahong, yang terhitung dari awal kegiatan penelitian yaitu proses sterilisasi hingga akhir kegiatan penelitian yaitu pemberian beberapa jenis sitokinin dengan konsentrasi yang berbeda sebagai perlakuan terhadap media kultur. Perhitungan dalam analisis secara deskriptif hanya meliputi persentase tingkat kontaminasi oleh jamur dan bakteri, pencoklatan browning serta kematian pada eksplan yang dijabarkan pada rumus berikut ini: Tingkat kontaminasi = ∑ eksplan terkontaminasi X 100 N Tingkat pencoklatan = ∑ eksplan mengalami pencoklatan X 100 N Tingkat kematian = ∑ eksplan mengalami kematian X 100 N Tingkat keberhasilan = ∑ eksplan yang bertunas X 100 N Keterangan : N= jumlah total eksplan yang tersedia tiap perlakuan Analisis data secara statistik dilakukan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL satu faktor yaitu pemberian beberapa jenis sitokinin AdSO 4 , BAP, kinetin, dan thidiazuron dengan konsentrasi yang berbeda 0,50; 1,00; 1,50; dan 2,00 mgl pada media MS. Penelitian ini terdiri dari 17 perlakuan dengan 10 ulangan sehingga terdapat 170 satuan percobaan. Model umum rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut Mattjik dan Sumertajaya 2000: Yij = µ + τi + εij Dimana : i = 1, 2, 3, ... 17 j = 1, 2, 3, ... 10 Keterangan: Yij = Hasil pengamatan terhadap eksplan binahong pada perlakuan ke i dan ulangan ke j µ = Nilai tengah umum rata-rata populasi τi = Pengaruh perlakuan ke i 1. MS Kontrol 2. MS + AdSO 4 0,50 mgl 3. MS + AdSO 4 1,00 mgl 4. MS + AdSO 4 1,50 mgl 5. MS + AdSO 4 2,00 mgl 6. MS + BAP 0,50 mgl 7. MS + BAP 1,00 mgl 8. MS + BAP 1,50 mgl 9. MS + BAP 2,00 mgl 10. MS + Kinetin 0,50 mgl 11. MS + Kinetin 1,00 mgl 12. MS + Kinetin 1,50 mgl 13. MS + Kinetin 2,00 mgl 14. MS + Thidiazuron 0,50 mgl 15. MS + Thidiazuron 1,00 mgl 16. MS + Thidiazuron 1,50 mgl 17. MS + Thidiazuron 2,00 mgl εij = Pengaruh galat percobaan pada eksplan binahong ke j yang memperoleh perlakuan ke i Untuk mengetahui pengaruh pemberian beberapa jenis sitokinin dengan konsentrasi yang berbeda pada penelitian ini maka dilakukan uji F dan selanjutnya dilakukan uji lanjutan wilayah Duncan untuk mengetahui beda antar perlakuan. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak SAS Statistical Analysis System 6.12. Pengujian Hipotesis Hipotesis yang dirumuskan dalam penelitian ini adalah: H0 = Pemberian perlakuan tidak memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap multiplikasi tunas dan pertumbuhan eksplan binahong H1 = Pemberian perlakuan memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap multiplikasi tunas dan pertumbuhan eksplan binahong Pengambilan keputusan uji F F hitung F tabel atau nilai P α 0,05 maka tolak Ho F hitung F tabel atau nilai P α 0,05 maka terima Ho

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Persentase Eksplan Steril

Sterilisasi pada Eksplan binahong Anredera cordifolia [Ten.] Stennis bertujuan untuk mendapatkan eksplan steril sehingga hambatan biologis berupa jamur dan bakteri yang merupakan sumber kontaminasi dapat dihilangkan. Eksplan hasil sterilisasi dapat dilihat pada gambar 2. Gambar 2 Tanaman binahong hasil sterilisasi. Teknik sterilisasi menggunakan larutan betadine dan alkohol 70 dan 96 yang dibedakan menjadi empat perlakuan yaitu sterilisasi I tidak menggunakan betadine dan alkohol, sterilisasi II menggunakan betadine 2 tetes dalam 100 ml, sterilisasi III menggunakan alkohol 70, dan sterilisasi IV menggunakan alkohol 96 yang diberikan setelah eksplan dicuci dengan air mengalir. Tingkat keberhasilan sterilisasi dapat dilihat pada tabel 3. Tabel 3 Tingkat keberhasilan sterilisasi dengan empat perlakuan yang berbeda pada eksplan binahong Anredera cordifolia [Ten.] Steenis Perlakuan ∑ Eksplan yang Ditanam Penyebab Kegagalan ∑ Eksplan yang Tumbuh Keberhasilan Sterilisasi Jamur ∑ Bateri ∑ Pencoklatan ∑ Mati ∑ I 166 7142,77 710,24 00 00 78 46,99 II 88 1719,32 44,55 00 33,41 64 72,73 III 152 31,97 53,29 10,66 21,32 141 92,76 IV 140 64,29 53,57 42,86 128,57 113 80,71