Cara Penularan Penyakit Koi Herpes Virus KHV

Setelah diinokulasikan, virus dapat terdeteksi dengan terlihatnya efek sitopatik yang cepat dalam kultur sel Sunarto 2005. 2.6 Polymerase Chain Reaction PCR 2.6.1 Single PCR PCR merupakan suatu teknik perbanyakan amplifikasi potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatenya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106 kali lipat dari jumlah nanogram DNA template Stephenson 2003. PCR dilakukan dengan bantuan alat yang disebut thermocycler Muladno 2010. Dalam proses PCR membutuhkan 4 komponen utama, yaitu 1 DNA template, 2 oligopolisakarida primer, 3 deoxyribonucleotida triphosphate dan 4 enzim polymerase. DNA template adalah frakmen DNA yang akan dilipatgandakan. Oligopolisakarida primer adalah suatu sekuen pendek dari oligonukleotida yaitu antara 15-25 basa nukleotida yang akan digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Deoxiribonucleotida triphosphate sering disebut dNTP, ini terdiri dari dATP, dCTP, dGTP dan dTTP. Enzim polymerase adalah enzim yang melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen lain yang juga penting adalah senyawa buffer Yuwono 2006. Reaksi pelipatgandaan suatu frakmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template sehingga rantai DNA yang berantai ganda akan dipisahkan menjadi rantai tunggal. Denaturasi menggunakan panas 90 C selama 1-2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi 55 C selama 1-2 menit, sehingga primer menempel annealing pada cetakan terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan template pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer Glick dan Pasternak 1998. Pada single PCR membutuhkan sepasang primer untuk proses annealing. Primer pertama adalah oligonukleotida dalam primer ini mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA template pada ujung 5’-fosfat, primer kedua adalah oligonukleotida yang identik dengan sekuen pada ujung 3’-OH rantai DNA template yang lain. Setelah proses annealing, suhu inkubasi ditingkatkan menjadi 72 C selama 1,5 menit. Pada suhu ini, DNA polymerase akan melakukan proses polimerase rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA template. Setelah polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA template . DNA rantai ganda akan terbentuk dengan adanya ikatan hidrogen antara DNA template dengan rantai DNA baru hasil polimerasi, selanjutnya akan didenaturasi lagi. Rantai DNA yang baru tersebut akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya Yuwono 2006. Proses amplifikasi tersebut diulang lagi sampai 25-30 kalisiklus sehingga pada akhir siklus akan mendapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang jauh lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada DNA target di dalam campuran reaksi Glick dan Pasternak 1998. Hasil amplifikasi ini dapat divisualisasikan dengan mata telanjang setelah melewati proses elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamida atau gel agarose. Prinsip elektroforesis adalah molekul DNA bermuatan negatif pada pH netral akan bermigrasi ke arah yang bermuatan positif. Migrasi molekul DNA pada gel elektroforesis dipengaruhi oleh komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Beberapa buffer yang digunakan diantaranya Tris Asetate EDTA TAE, Tris pHospate EDTA TBE dan Tris Borate EDTA TPE, serta buffer alkalin elektroforesis Sambrook et al. 1989. Pada saat elektroforesis, molekul DNA akan berikatan dengan ethidium bromida EtBr sehingga molekul DNA tersebut dapat divisualisasikan dibawah lampu ultra violet.