Gambar 7 Perubahan makroskopis suspect KHV: aptechiae pada ekor, b ptechiae pada sirip punggung, c ptechiae dan nekrosis pada ekor, d
ptechiae pada sirip dada, e hemmorhagi pada bagian caudal, fnekrosis pada kulit bagian caudal dan ekor, g bercak putih ringan pada insang,
h nekrosis pada insang, dan i ptechiae pada ginjal Tabel 6 Perubahan makroskopis pasca infeksi virus KHV 10
Keterangan Kelompok Ikan Uji Coba Ekor
1 2 3 4
A B A B A B A B
Lesi putih pada insang 1
2 3
Nekrosis pada insang 4
7 4
8 3
Nekrosis pada sirip punggung
1 0 0 2 0 0 1 0 Nekrosis pada sirip ekor
4 5
2 5
1 Lesi pada kulit
1 Ptechiae pada ginjal
1 1
4.4.3 Pemeriksaan Biologi Molekuler dengan Metode Nested PCR
Nested PCR adalah salah satu teknik untuk mendiagnosa suatu penyakit dengan tingkat sensifitas dan spesifitas yang tinggi. Nested PCR dilakukan 2 kali
siklus amplifikasi dengan menggunakan 2 pasang primer sehingga dapat mendeteksi material dalam jumlah sedikit.
Mekanisme kerja dari Nested PCR adalah memperbanyak potongan DNA
dengan bantuan enzim DNA polymerase dan dua pasang primer. Pasangan primer pertama akan mengamplifikasi fragmen dengan cara kerja mirip single
PCR atau PCR biasa. Pasangan primer kedua biasanya disebut nested primers yang berikatan di dalam fragmen
DNA produk PCR pertama untuk
memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua, yang mana hasilnya lebih pendek dari primer pertama. Dengan menggunakan nested PCR,
jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua sangat rendah. Dengan
g h
i
demikian, nested PCR adalah salah satu teknik PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi
http:www.pcrstation.comnested pcr
. Pada penelitian ini digunakan metode uji biologi molekuler nested PCR
dengan menggunakn Kit IQ2000
TM
spesifik terhadap KHV. Pada uji nested PCR ini dilengkapi dengan 2 pasang primer yang lebih sensitif dan spesifik dalam
mendiagnosa KHV. Namun nested PCR pada prosedur IQ2000
TM
ini hanya dapat mendeteksi virus KHV pada batas jumlah copies DNA tertentu. Deteksi virus
KHV dari sampel organ insang sebanyak 20-1000 copies DNA, sampel larva 1cm sebanyak 20-10.000 copies DNA dan hasil swab sebanyak 20-200 copies
DNA, sedangkan deteksi virus KHV dari sampel DNA plasmid KHV sebanyak 2 copies DNA KHV. Jumlah copies DNA tersebut menentukan sensitifitas dan
spesifisitas dalam deteksi virus KHV Farming IntelliGene Tech Corp 2010. Gen target dari primer KIT IQ2000
TM
KHV adalah 2 pita DNA utama yaitu pita DNA dengan panjang 229 bp dan atau 440 bp. Namun dapat pula
terbentuk pada panjang 630bp Farming IntelleGene Tech Corp 2010. Pita DNA yang tervisualisasi pada 229bp setara dengan 20 copies DNA. Pita DNA yang
tervisualisasi pada 440bp setara dengan 200 copies DNA. Pita DNA yang tervisualisasi pada 630bp setara dengan 2000 copies DNA www.iq2000kit.com.
Sunarto 2007 mengungkapkan bahwa pita DNA yang terbentuk pada panjang 630 bp merupakan bentuk visualisasi dari kasus KHV dengan tingkat virulensi
yang sangat tinggi. Pada penelitian ini, visualisasi dari produk PCR terlihat pada pita DNA
kedua yang tersekuensing sebanyak 440 basepare bp. Yang mana produk PCR ini merupakan hasil dari amplifikasi primer pertama yaitu forword-1 dan reverse-
1. Setelah amplifikasi dengan primer pertama selesai, amplifikasi dilanjutkan oleh primer kedua yaitu forword-2 dan reverse-2 dan menghasilkan produk PCR kedua
yang tertera pada pita DNA pertama 229 bp. Selanjutnya akhir dari running pada amplifikasi kedua, primer pertama dan primer kedua tercampur sehingga muncul
pita DNA ketiga yang tersekuensing pada 630bp. Lima dari 12 sampel organ insang ikan Koi positif KHV, 3 diantaranya
digunakan sebagai stock virus karena mempunyai perbedaan kuantitas dan semikualitas gen taget KIT PCR IQ2000TM KHV. Stock virus KHV tersebut
berkode D139, D143, D144 dan M628. Yang mana isolat virus KHV dengan kode D139 berstatus positif KHV dengan panjang 229bp dan setara dengan 20
copies DNA, D143 berstatus positif KHV dengan panjang 440bp dan setara dengan 200 copies DNA, dan D144 berstatus positif KHV dengan panjang 630bp
dan setara dengan 2000 copies DNA. Pada virus M628 mempunyai kuantitas dan semikuantitas sama dengan isolat virus KHV berkode D144. Oleh karenanya
isolat D139 dikategorikan positif +, isolat D143 dikategorikan positif ++, isolat D144 dan M628 dikategorikan positif +++.
Berdasarkan hasil pemeriksaan biologi molekuler dengan metode Nested PCR, masing-masing kelompok ikan coba menunjukkan hasil elektroforesis uji
nested PCR dengan semikualitas yang berbeda Gambar 8-15. Diagnosa ikan terserang penyakit KHV terlihat pada kelompok 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A dan
4B yaitu 55, 710, 55, 810, 05, 010, 45 dan 05 Tabel 6.
Gambar 8 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 1A: lane M marker, lane K+ kontrol positif, line K- kontrol negatif, line 1,2,3,4 dan 5 adalah sampel
insang ikan coba positif KHV
Gambar 9 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 1B: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane 1,2,4,6,7,8 dan 10 adalah sampel
insang ikan coba positif KHV, lane 3, 5 dan 9 adalah adalah sampel insang ikan coba negatif KHV
Gambar 10 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 2A: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane 1,2,3,4 dan 5 adalah adalah
M K+ 2
1 K- 3
4 5
M K+
K- 1 2
3 4 5 6 7
9 8
10
3 4 5 2
1 M K+ K-
848bp 630bp
333bp 229bp
630bp 440bp
333bp 630bp
848bp
333bp 630bp
848bp 229bp
440bp 630bp
229bp 440bp
630bp
sampel insang ikan coba positif KHV
Gambar 11 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 2B: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, , lane 1,2,3,5,7,8,9, dan
10 adalah sampel insang ikan coba adalah positif KHV, lane 4 dan 6 adalah adalah sampel insang ikan coba negatif KHV
Gambar 12 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 3A: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane1,2,3,4 dan 5 adalah adalah
sampel insang ikan coba negatif KHV
Gambar 13 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 3B: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane 1,2,3,4,5,6,7,8,9 dan 10
adalah adalah sampel insang ikan coba negatif KHV
Gambar 14 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 4A: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane 1,3,4 dan 5 adalah adalah
sampel insang ikan coba positif KHV, lane 2 adalah adalah sampel insang ikan coba negatif KHV
M K+ 1 K- 3
4 2 5
6 7
8 9
10
M K+ K- 1 2 3 4 5
M K+ K- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M K+ K- 1 2 3 4 5
630bp 440bp
229bp 630bp
333bp 848bp
848bp 630bp
333bp
333bp 848bp
630bp
333bp 848bp
630bp 229bp
630bp 440bp
Gambar 15 Hasil elektroforesis uji nested PCR kelompok 4B: lane M marker, lane K+ kontrol positif, lane K- kontrol negatif, lane 1,2,3,4 dan 5 adalah adalah
sampel insang ikan coba negatif KHV Tabel 7 Hasil pemeriksaan sampel insang dengan metode nested PCR
Kelompok Ikan Coba
Hasil pemeriksaan dengan metode PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1A + ++
++ +
+ 1B +
++ -
++ -
+++ +
+ -
+ 2A
+ +++ +
++ ++
2B ++ +++ + - + - + + + ++
3A - - - - -
3B - - - - - - - - - -
4A + - +
++ ++
4B - - - - -
Ikan coba yang telah diinjeksi virus KHV10 telah menunjukkan aktivitas virus KHV dalam tubuh. Bahkan ikan coba yang sakit telah menularkan virus
KHV pada ikan-ikan kohabitasi yang berada dalam satu akuarium. Hal ini terlihat dengan adanya gejala klinis, perubahan makroskopis dan konfirmasi dari uji
nested PCR. Diagnosa penyakit KHV pada kelompok 1A terdapat 55 ekor, kelompok 1B terdapat 75 ekor, 2A terdapat 55 ekor, 2B terdapat 85 ekor dan 4ª
terdapat 45 ekor namun tidak terjadi pada kelompok 3A, 3B dan 4B Tabel 8. Tabel 8 Diagnosa Penyakit KHV
Keterangan Kelompok Ikan Ekor
1A 1B 2A 2B 3A 3B 4 A
4B
Stock Virus KHV D144
D143 D139
M628 ∑ ikan diinjeksi suspensi KHV 10
5 5
5 5
5 5
5 5
∑ikan kohabitasi
0 5 0 5 0 5 0 0 ∑ikan
dalam akuarium
5 10 5 10 5 10 5 5 ∑ikan di diagnosa sakit akibat
penyakit KHV 55 710 55 810 05 010 45 05
M K+ K- 1 2 3 4 5
333bp 333bp
333bp
4.5 Patogenesa Penyakit KHV
