Gambar 2 Proses amplifikasi ekstrak DNA dalam thermocycler
2.6.2 Nested PCR
Ada berbagai metode PCR, diantaranya adalah Nested PCR. Metode Nested PCR ini biasanya digunakan untuk mendiagnosa suatu penyakit dengan
tingkat sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi.
Gambar 3 Diagram amplifikasi pada nested PCR
Pada prinsipnya, nested PCR menggunakan 2 pasang primer dengan 2 kalisiklus amplifikasi, hal ini berbeda dengan PCR biasa atau single PCR yang
mana hanya menggunakan 1 pasang primer dengan 1 kali siklus amplifikasi. Oleh karenanya nested PCR lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan single
PCR, sehingga mampu untuk mendeteksi virusbakteri dalam jumlah sedikit. Tabel 1 Master mix I dari nested PCR
Keterangan Volume
dNTP mix 2mM each dNTP 5 µl
10x PCR buffer 15mM MgCl2 5 µl
Taq polymerase 0.2U 0.2 µl
dH2O 25.8 µl
Primer mix. Forward and Reverse primers 5 pmolesµl each
4 µl
Total Mastermix Volume: 40 µl
DNA Template 10 µl
Tabel 2 Master mix II dari nested PCR
Keterangan Volume
dNTP mix 2mM each dNTP 5 µl
10x PCR buffer 15mM MgCl2 5 µl
Taq polymerase 0.2U 0.2 µl
dH2O 35.8 µl
Primer mix. Forward and Reverse primers 5 pmolesµl each
4 µl
Total Mastermix Volume: 49 µl
DNA Template Sample from external round PCR product
1 µl
Tabel 3 Siklus amplifikasi-nested PCR
PCR Machine Cycling Parameters For Both External and Internal PCR Rounds
94ºC30 sec 1 cycle
94ºC30 sec. 55ºC30 sec.
72ºC30 sec. to 120 sec. 35 cycles
4ºC Hold http:www.pcrstation.comnested-pcr
.
III. METODOLOGI 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Virologi dan Uji Coba Balai Riset Kelautan dan Perikanan Jakarta, Laboratorium Kesehatan Satwa Akuatik
FKH-IPB, Laboratorium Virologi dan Uji Coba Balai Besar Karantina Ikan Makassar, dan Laboratorium Kualitas Air Fakultas Kelautan dan Ilmu Perikanan
Universitas Hasanuddin Sulawesi Selatan. Penelitian ini dilakukan mulai bulan November 2010 sampai Oktober 2011.
3.2 Materi dan Metode Penelitian 3.2.1 Materi Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuarium, termometer, cecker water quality, aerator dan ikan Koi dari daerah bebas KHV
Takkalar, Sulawesi Selatan, untuk uji coba infeksi dan kohabitasi. Alat lain yang digunakan adalah scalpel, pinset, timbangan, cawan petri, mortar-pastel,
sentrifuse, filter 0.45µl, tabung mikro, tissue steril dan bahan yang digunakan adalah insang suspect KHV dan phosphate buffer saline PBS pH 7.1 untuk
membuat suspensi KHV 10. Selain itu, bahan yang digunakan adalah mikropipet, tabung mikro, blok pemanas, sentrifuse, incubator, pestel, vortex,
tissue steril dan bahan berupa ethanol 95, lysis buffer dan ddH
2
O untuk ekstraksi DNA. Alat thermal cycler dengan blok sampel 0.2 ml, peralatan elektroforesis,
UV illuminator, vortex mixer, mikropipet dan camera digital foto system merupakan rangkaian peralatan untuk uji PCR. Dalam uji PCR ini menggunakan
ekstrak DNA, bahan ethidium bromide EtBr, ethanol 95, TAE atau TBE elektroforesis buffer, agarose dan Kit IQ 2000
TM
KHV.
3.2.2 Metode Penelitian 3.2.2.1 Identifikasi Koi herpesvirus dari Organ Insang Ikan Koi dengan
Metode Nested PCR
Sampel ikan Koi yang diduga sakit akibat serangan KHV diambil dari kolam ikan Koi milik petani. Ikan Koi tersebut dinekropsi dan diambil organ
insangnya, kemudian disimpan dalam freezer -80
O
C. Untuk membuktikan adanya virus KHV pada sel maka dilakukan pengujian dengan menggunakan metoda PCR
Kategori