Pembuatan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Jambu Bol Pembuatan Fraksi n-Heksan, Fraksi Etilasetat dan Fraksi Air Sterilisasi Alat dan Bahan

38

3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Serbuk Simplisia Daun Jambu Bol

Pembuatan ekstrak etanol daun jambu bol dilakukan dengan cara maserasi menggunakan etanol 80 Depkes RI, 1979. Cara kerja : Sebanyak 900 g serbuk simplisia daun jambu bol dimasukan ke dalam wadah berkaca berwarna gelap, kemudian dituangi dengan 8,5 L etanol 80. Ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya sambil sering diaduk, diserkai dan diperas. Ampas dicuci dengan 2,5 L etanol 80, dipindahkan ke dalam bejana tertentu, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari cahaya selama 2 hari, selanjutnya dienap tuangkan. Maserat etanol yang diperoleh diuapkan denagn menggunakan rotary evaporator pada temperature ± 40 o C sampai diperoleh ekstrak kental kemudian dikeringkan menggunakan hair dryer dan freezer.

3.7 Pembuatan Fraksi n-Heksan, Fraksi Etilasetat dan Fraksi Air

Sebanyak 10 g ekstrak etanol ditambahkan 10 mL aquadest lalu ditambahkan 40 ml n-heksan, dikocok dalam corong pisah dan dibiarkan sampai memisah, kemudian dipisahkan, selanjutnya difraksinasi kembali dengan menggunakan pelarut n-heksan hingga diperoleh fraksi n-heksan yang jernih tidak memberikan reaksi positif dengan penambahan pereaksi Lieberman- Burchard, kemudian fraksi air ditambahkan 50 mL etilasetat, dikocok dan dibiarkan memisah. Lapisan etilasetat dipisahkan dan fraksinasi dilanjutkan sampai diperoleh fraksi etilasetat yang jernih tidak memberikan hasil positif dengan penambahan pereaksi FeCl 3 . Kumpulan hasil fraksi n-heksan, fraksi etilasetat dan fraksi sisi air masing-masing diuapkan dengan rotary evaporator Universitas Sumatera Utara 39 pada temperatur ± 40°C sampai diperoleh ekstrak kental, kemudian dikeringkan dengan hair dryer dan freezer. 3.8 Pembuatan Media untuk Bakteri Uji 3.8.1 Nutrient agar NA Komposisi : ‘Lab-Lemco’ powder 1,0 Yeast extract 2,0 Peptone 5,0 Sodium chloride 5,0 Agar 15,0 Cara pembuatan: Sebanyak 28 g serbuk Nutrient Agar NA dilarutkan dalam 1 L air suling steril dan dipanaskan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.8.2 Nutrient broth NB

Komposisi : ‘Lab-Lemco’ powder 1,0 Yeast extract 2,0 Peptone 5,0 Sodium chloride 5,0 Cara pembuatan: Sebanyak 13 g serbuk Nutrient Broth NB dilarutkan dalam 1 L air suling steril dan dipanaskan sampai semua bahan larut sempurna, kemudian disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit Oxoid, 1982.

3.8.3. Pembuatan agar miring

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril 3 mL media Nutrient Agar NA steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai membeku pada posisi membentuk sudut 45 o C, kemudian tabung disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5 o C. Universitas Sumatera Utara 40 3.9 Pembuatan Stok Kultur 3.9.1. Pembuatan stok kultur bakteri Staphylococcus aureus Satu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media Nutrient Agar NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C selama 24 jam Ditjen POM RI, 1995.

3.9.2 Pembuatan stok kultur bakteri Staphylococcus epidermidis

Satu koloni bakteri Staphylococcus epidermidis diambil dengan jarum ose steril, lalu diinokulasikan pada permukaan media Nutrient Agar NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C selama 24 jam Ditjen POM RI, 1995. 3.9.3 Pembuatan stok kultur bakteri Pseudomonas aeroginosa Satu koloni bakteri Pseudomonas aeroginosa diambil dengan jarum ose lalu diinokulasikan pada permukaan media Nutrient Agar NA miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C selama 24 jam Ditjen POM RI,1995. 3.10 Pembuatan Inokulum Bakteri 3.10.1 Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus aureus Koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, kemudian disuspensikan ke dalam 10 mL larutan Nutrient Broth NB steril lalu diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM RI, 1995. Universitas Sumatera Utara 41 3.10.2 Pembuatan inokulum bakteri Staphylococcus epidermidis Koloni bakteri Staphylococcus epidermidis diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, kemudian disuspensikan ke dalam 10 mL larutan Nutrient Broth NB steril lalu diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM RI, 1995.

3.10.3 Pembuatan inokulum bakteri Pseudomonas aeroginosa

Koloni bakteri Pseudomonas aeroginosa diambil dari stok kultur dengan menggunakan jarum ose steril, kemudian disuspensikan ke dalam 10 mL larutan Nutrient Broth NB steril lalu diinkubasikan pada suhu 35 ± 2 o C sampai didapat kekeruhan dengan transmitan 25 menggunakan alat spektrofotometer UV panjang gelombang 580 nm Ditjen POM RI, 1995.

3.11 Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas antibakteri ini disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Media disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit dan alat-alat gelas lainnya disterilkan di oven pada suhu 160-170 o C selama 2-3 jam. Jarum ose dibakar dengan lampu bunsen Pratiwi, 2008. 3.12 Pembuatan Larutan Uji Ekstrak dan Fraksi Daun Jambu Bol dengan Berbagai Konsentrasi Sebanyak 2 g ekstrak dan fraksi daun jambu bol ditimbang, lalu ditambahkan dimetil sulfoksida DMSO hingga volume total 4 mL dan diaduk hingga larut dan didapat konsentrasi 500 mgmL atau 50 bv, kemudian dibuat Universitas Sumatera Utara 42 pengenceran dengan konsentrasi 400 mgmL; 300 mgmL; 200 mgmL; 100 mgmL; 75 mgmL; 50 mgmL; 25 mgmL; 12,5 mgmL dan 6,25 mgmL.

3.13 Pengujian Aktivitas Antibakteri terhadap Ekstrak dan Fraksi