PC x V Yield =
DB Keterangan: PC = Konsentrasi fikosianin mgmL
V = Volume pelarut mL DB = Biomassa kering gram
Metode yang memberikan hasil konsentrasi fikosianin terbaik adalah fikosianin dengan nilai optical density OD tertinggi yang akan digunakan untuk analisis
inhibisi enzim α-glukosidase, aktivitas antioksidan dan komponen fitokimia.
3.3.2 Prosedur analisis 1
Uji inhibisi α-glukosidase Sutedja 2003 diacu dalam Sugiwati 2005
Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1 mg α-glukosidase dalam 100 mL
bufer fosfat pH 7 yang mengandung 200 mg bovin serum albumin. Sebelum digunakan, 1 mL larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat pH
7. Cam puran reaksi terdiri dari 250 μL p-nitrofenil-α-D-glukopiranosa 20 mM
sebagai substrat, 490 μL bufer fosfat 100 mM, pH 7 dan 10 μL larutan ekstrak fikosianin dalam bufer dan biomassa Spirulina platensis dalam DMSO. Setelah
campuran reaksi diinkubasi p ada suhu 37°C selama 5 menit, 250 μL larutan enzim
ditambahkan dan selanjutnya diinkubasi selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan penambahan 1000 μL natrium karbonat 200 mM, kemudian nilai absorbansi
p-nitro fenol dibaca pada panjang gelombang 400 nm. Sistem reaksi enzim dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Siste m reaksi inhibisi α-glukosidase
Blanko μL Kontrol μL
S0 μL S1 μL
Sampel -
- 10
10 DMSO
10 10
- -
Bufer 490
490 490
490 Substrat
250 250
250 250
Inkubasi selama 5 menit dengan suhu 37°C Bufer
250 -
250 -
Enzim -
250 -
250 Inkubasi selama 15 menit dengan suhu 37°C
Na
2
CO
3
1000 1000
1000 1000
Larutan standar acarbose dibuat dengan konsentrasi yang sama dengan larutan sampel dengan melarutkan tablet acarbose Glucobay
®
dalam akuades dan HCl 2 N. Larutan disentrifugasi dan supernatannya digunakan sebagai standar.
Larutan standar diperlakukan sama dengan sampel. Masing-masing pengujian daya hambat sampel terhadap aktivitas α-glukosidase dihitung dalam persen inhibisi
dengan rumus sebagai berikut. K- S1-S0
inhibisi = x 100
K Keterangan :
K : Absorbansi terkoreksi dari blanko enzim + substrat
S1 : Absorbansi terkoreksi dari enzim + substrat + inhibitor
S0 : Absorbansi terkoreksi dari substrat + inhibitor
2 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Sampel biomassa kering dan fikosianin dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm, 800 ppm, dan 1.000 ppm untuk biomassa
kering dan 200 ppm, 400 ppm, 800 ppm, 1.600 ppm, dan 2.000 ppm untuk fikosianin. Pembanding dan kontrol positif menggunakan antioksidan sintetik tokoferol yang
dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 2 ppm, 4ppm, 6 ppm, dan 8 ppm. Larutan l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH yang akan
digunakan dibuat menggunakan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan dalam kondisi
suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Sebanyak 2,25 mL larutan sampel dan larutan tokoferol, masing-masing
direaksikan dengan 0,25 mL larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Uji dilakukan secara duplo. Campuran larutan DPPH dan sampel dihomogenisasi dengan vorteks,
lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer dengan
λ= 517 nm. Larutan blanko dibuat dengan 2,25 mL pelarut metanol direaksikan dengan 0,25 mL larutan DPPH 1 mM dalam
tabung reaksi. Persen inhibisi diukur dari data absorbansi larutan blanko. Setelah itu,
aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding tokoferol dinyatakan dengan persen inhibisi yang dihitung dengan rumus berikut:
absorbansi blanko – absorbansi sampel inhibisi =
x 100 absorbansi blanko
Nilai konsentrasi sampel dan persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang
diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx digunakan untuk mencari nilai Inhibitor Concentration 50 IC
50
dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50.
3 Uji fitokimia
Pengujian fitokimia dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya komponen- komponen bioaktif yang terdapat pada biomassa Spirulina platensis yang memiliki
aktivitas antioksidan yang terbaik. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, steroidtriterpenoid, flavonoid, saponin dan fenol hidrokuinon. Metode uji ini
berdasarkan Harborne 1984. a
Alkaloid Sejumlah sampel ± 10 mg dilarutkan dalam beberapa tetes asam sulfat
H
2
SO
4
2 N. Pengujian menggunakan tiga pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner.
Pereaksi Dragendorff dibuat dengan cara 0,8 gram bismut subnitrat ditambahkan dengan 10 mL asam asetat dan 40 mL air. Larutan ini dicampur dengan
larutan yang dibuat dari 8 gram kalium iodida dalam 20 mL air. Sebelum digunakan, 1 volume campuran ini diencerkan dengan 2,3 volume asam asetat glasial dan 100
mL air. Pereaksi ini berwarna jingga.
Pereaksi Meyer dibuat dengan cara menambahkan 1,36 gram HgCl
2
dengan 0,5 gram KI, lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 100 mL dengan
labu takar. Pereaksi ini tidak berwarna. Pereaksi Wagner dibuat dengan cara 10 mL akuades ditambahkan 2,5 gram
iodin dan 2 gram KI lalu dilarutkan dan diencerkan dengan akuades menjadi 200 mL dalam labu takar. Pereaksi ini berwarna coklat.
Hasil uji dinyatakan positif, bila dengan pereaksi Dragendorff terbentuk endapan merah hingga jingga, endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer dan
endapan coklat dengan pereaksi Wagner. b
Steroidtriterpenoid Sejumlah sampel ± 10 mg dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung
reaksi yang kering. Setelah itu ditambahkan 10 tetes anhidra asetat dan 3 tetes asam sulfat pekat. Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknya larutan berwarna merah
untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau. c
Flavonoid Sejumlah sampel ± 10 mg ditambahkan 0,1 mg serbuk magnesium dan 0,4
mL amil alkohol campuran asam klorida 37 dan etanol 95 dengan volume yang sama dan 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Adanya flavonoid ditunjukkan
dengan terbentuknya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol. d
Saponin Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil
selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan adanya saponin.
e Fenol hidrokuinon
Sejumlah sampel ± 1 gram diekstrak dengan 20 mL etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5. Warna hijau atau hijau biru yang terbentuk menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pertumbuhan Spirulina platensis
