53
BAB 6 RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Sejauh ini, secara keseluruhan penelitian tahun pertama telah dilaksanakan. Pada tahun kedua akan dilanjutkan dengan kegiatan penelitian
sebagaimana pada Gambar 24, yaitu : 1. Mengkaji
efek perlakuan
senyawa 1-
4’-bromofenil-3-4-hidroksi-3- metoksifenil-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap
daur sel HeLa dan T47D. 2. Mengamati perubahan ekspresi protein regulator daur sel cyclin Dcyclin E
cyclin B pada sel HeLa dan T47D dengan adanya perlakuan senyawa 1- 4’-
bromofenil-3-4-hidroksi-3-metoksifenil-2-propen-1-on, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya
Gambar 24. Bagan Alir Penelitian Metode penelitian yang dilakukan adalah :
1. Uji Penghambatan Daur Sel dengan Flowcytometry
a. Alat yang digunakan : Flowcytometer FACSCalibur,pPerlengkapan
perlindungan diri sarung tangan steril, jas lab., waterbath yang telah distel temperaturnya 37°C, Laminar Air Flow Hood LAF, inkubator CO
2
, tissue culture flaskdish, pen marker, mikropipet, tip, rak ampultempat eppendorf,
tissue, alat-alat gelas, flakon, timbangan analitik, mikroskop cahaya, inverted
Uji penghambatan daur sel perlakuan senyawa derivat kalkon
bersubstitusi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel
HeLa sel T47D sel pada
setiap daur sel
Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin,
dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan dalam daur sel cycDcyc E cycB
Ekspresi protein cycDcyc E
cycB
TAHUN II
54 microscope, tabung konikal, haemocytometer, cell counter, kamera digital,
autoklaf, filter, vorteks, sentrifus. b.
Bahan yang digunakan: Reagen propidium iodida PI : 7 triton X
Merck, 0,2 RNase, 5 PI Sigma 0,1 mg dalam PBS, dilarutkan
dengan PBS hingga 100. c.
Prosedur Kerja
Sel hasil panen ditumbuhkan pada plate kultur 6 sumuran sejumlah 5 x 10
5
selsumuran. Setelah inkubasi selama 24 jam sel diberi perlakuan dengan 1- 4”-
fluorofenil-3- 4’-hidroksi-3’-metoksifenil-2-propen-1-on
pada berbagai
konsentrasi. Pemanenan sel dilakukan pada jam ke 24 dan jam 48 setelah perlakuan. Sel dipanen menggunakan tripsinEDTA 0.250.02, kemudian
disentrifugasi 1000 RPM selama 5 menit, dan dicuci dengan PBS dingin. Sel diinkubasi dengan larutan propidium iodida PI 500 ml PI 50 mgml dalam PBS
yang mengandung 0.1 triton-X. Sel selanjutnya diberi perlakuan dengan RNAse bebas DNAse 20 mgml selama 10 menit pada suhu 370C. Sel dianalisis
dengan alat flowcytometer BD FACSCalybur.
2. Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia
a. Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop
cahaya. b.
Bahan yang digunakan : Aseton E.Merck, serum kambing normal
Novocastra, antibodi primer terhadap cyclin, PBS, streptavidin, biotin, antibodi IgG sekunder terbiotinilasi Novocastra, konjugat streptavidin
terhadap peroksidase kuda Novocastra, kromogen 3,3-diaminobenzidin
DAB Novocastra, akuades, dan mayer-hematoksilin Dako. c.
Prosedur Kerja
Sel kepadatan 5 X 10
4
selsumuran ditanam pada coverslips dalam plate 24 sampai 80 konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama
4 dan 8 jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS. Selanjutnya dilakukan fiksasi dengan formalin 4 selama 20 menit, cuci PBS, dilanjutkan dengan dehidrasi
menggunakan etanol konsentrasi bertingkat yaitu 50, 70 dan 95, masing-masing selama 5 menit. Cover slip yang memuat sel diangkat, diletakan diatas dish 6 cm.
55 Ditetesi dengan normal mouse serum 1:50 selama 15 menit, dibuang tanpa
cuci, lalu ditetesi dengan Primer Antibodi Monoklonal anti Bax dan Bcl-2 selama 60 menit dan dicuci dalam PBS sebanyak 3 kali. Preparat diinkubasi dalam biotin
selama 10 menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Kemudian preparat diinkubasi dalam streptavidin-peroksidase selama 10 menit
dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Selanjutnya, preparat diinkubasi dalam DAB selama 3-8 menit dan dicuci dengan akuades. Preparat
direndam dalam hematoksilin selama 3-4 menit untuk counterstain dan dicuci dengan akuades. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop cahaya. Sel
yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklatgelap,
sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu.
56
BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN
