Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop

27

b. Bahan yang digunakan : 1X Working Solution 1 mL 100X Stock Solution

diencerkan menjadi 1100 dalam Phosphat Buffer Saline PBS dan Annexin- V-Fluos Staining Kit Roche. c. Prosedur Kerja Sel kepadatan 5 X 10 5 selsumuran ditanam dalam plate 6 well sampai 50-60 konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam. Medium diambil dan dimasukkan dalam tabung sentrifus. Sel di cuci dengan tripsin 0,25 untuk melepas sel dari plate dan dilakukan inkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO 2 . Kemudian ditambahkan media kultur 1 mL. Sel beserta media kultur tersebut dipindahkan juga dalam tabung sentrifus. Selanjutnya sel yang masih tersisa dalam plate dicuci dengan PBS 2X masing-masing sebanyak 1 mL dan PBS ditambahkan dalam tabung sentrifus. Kemudian disentrifus pada 600 g selama 5 menit. Media dibuang dan sel dicuci dengan PBS 1 mL dan disentrifus pada 200 g selama 5 menit. Larutan PBS dibuang dan sel diresuspensi dengan 100 mL Annexin-V-Fluos-labelling solution yang terdiri dari 2 L Annexin-V-Fluos, 100 L buffer, dan 2 L propidium iodide untuk 1 kali reaksi. Inkubasi selama 10 menit pada ruang gelap dan dianalis dengan flowcytometer.

3. Uji Penghambatan Ekspresi Protein dengan Imunositokimia

a. Alat yang digunakan : coverslips, plate 24 well, incubator, mikroskop

cahaya. b. Bahan yang digunakan : Metanol Merck, Etanol Merck, PBS, akuades, hydrogen peroksida H 2 O 2 , antibodi primer terhadap Bcl-2 Biocare dan Bax, Starr Trek Universal HRP Detection Kit Biocare, mayer- hemaktoksilin Dako, xylol, enteler. c. Prosedur Kerja Sel kepadatan 5 X 10 4 selsumuran ditanam pada coverslips dalam plate 24 sampai 80 konfluen. Setelah itu diinkubasi dengan senyawa uji selama 24 jam. Medium diambil, dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya sel dalam coverslips difiksasi dengan metanol dingin dan dicuci PBS 2 kali, kemudian dicuci dengan akuades 2 kali. Coverslips dipindahkan dalam slide kemudian ditambahkan 300 L H 2 O 2 1: 9 dalam akuades, kemudian diinkubasi selama 10 menit, dibuang 28 dan dicuci dengan PBS 2 kali. Selanjutnya di tambahkan 100 L Blocking Background Snipper, inkubasi selama 15 menit pada suhu kamar, dibuang dan ditambahkan 50 L antibodi primer Bcl-2 atau Bax inkubasi selama 60 menit. Setelah dibuang dicuci dengan PBS 2 kali, kemudian tambahkan 100 L antibody sekunder Trekkie Universal inkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Setelah dibuang, dicuci dengan PBS 2 kali dan ditambahkan Trek Avidin-HRP, diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, dibuang dan dicuci dengan PBS 2 x. Dilanjutkan dengan penambahan 100 L DAB, diinkubasi 5 menit, dibuang, dan dicuci dengan akuades. Setelah dibuang dan dibersihkan dengan tissue ditambahkan dengan 300 L mayer-hemaktoksilin dan diinkubasi 5 menit. Kemudian dicuci dengan akuades hingga bersih. Slide preparat dicelup dalam etanol, kemudian dicelup dalam xylol. Setelah kering ditutup dengan cover glass dan ditambahkan enteler. Ekspresi protein diamati menggunakan mikroskop. Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklatgelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungu. Bagan alir penelitian tahun pertama disajikan pada Gambar 2. Gambar 2. Bagan alir penelitian pada tahun pertama Senyawa Derivat Kalkon Bersubstitusi Bromo 1- 4’-bromofenil -3-4-hidroksi-3-metoksifenil-2-propen-1- on Uji aktivitas sitotoksik kombinasi senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo dan Doksorubisin pada sel HeLa sel T47D IC 50 viabilitas sel nilai CI Doksorubisin Uji aktivitas sitotoksik senyawa derivat kalkon bersubstitusi bromo dan Doksoribisin tunggal pada sel HeLa sel T47D Uji induksi apoptosis perlakuan senyawa derivate kalkon bersubstitusi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya pada sel HeLa sel T47D sel yang mengalami apoptosis Uji efek senyawa derivat kalkon bersubstutisi bromo, Doksorubisin, dan kombinasi keduanya terhadap ekspresi protein yang berperan dalam apoptosis : Bcl-2 dan Bax. Ekspresi protein Bcl-2 dan Bax TAHUN I 29

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

A. HASIL PENELITIAN

1. Uji Sitotoksik

Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui sifat sitotoksik dari senyawa 1- 4’-bromofenil -3-4-hidroksi-3-metoksifenil-2-propen-1-on, baik pada penggunaan tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel HeLa dan T47D. Pada penelitian ini uji sitotoksisitas dilakukan menggunakan metode MTT.

a. Uji Sitotoksik Terhadap Sel HeLa

1 Uji sitotoksik senyawa 1- 4’-bromofenil -3-4-hidroksi-3-metoksifenil-2- propen-1-on terhadap sel HeLa Potensi ketoksikan senyawa 1-4 ’-bromofenil -3-4-hidroksi-3- metoksifenil-2-propen-1-on terhadap sel HeLa dinyatakan dalam bentuk grafik hubungan antara konsentrasi dengan prosentase viabilitas sel Gambar 3, dan data selengkapnya disajikan pada Lampiran 1. Berdasarkan hasil pengamatan tersebut menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi senyawa yang diberikan, semakin renah viabilitas sel Hela atau semakin banyak jumlah sel HeLa yang mengalami kematian. Berdasarkan hasil perhitungan Lampiran 1 diperoleh nilai IC 50 dari senyawa ini terhadap sel HeLa sebesar 50 M. Gambar 3. Hubungan konsentrasi senyawa 1- 4’-bromofenil -3-4-hidroksi-3- metoksifenil-2-propen-1-on dengan viabilitas sel HeLa Morfologi sel HeLa karena perlakuan senyawa 1- 4’-bromofenil -3-4- hidroksi-3-metoksifenil-2-propen-1-on disajikan pada Gambar 4. Bila IC 50 = 50 M